姜 燕，曹亞男，柳學(xué)周，徐永江，李德軍，史 寶，王 濱

( 1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室， 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266071； 2.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264000； 3.青島市黃島區(qū)漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東 青島 266400 )

微生物存在于環(huán)境的每一個角落，與人類的生活息息相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，在人體腸道中居住著數(shù)以萬億計的微生物[1]。微生物在腸道的大環(huán)境中以其內(nèi)容物為基質(zhì)進行發(fā)酵，能夠分泌產(chǎn)生維生素、氨基酸、酶等多種有用代謝產(chǎn)物，在滿足自身生長繁殖需求的同時還能促進宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[2-6]。并且，腸道內(nèi)的微生物能夠通過產(chǎn)物抑制、營養(yǎng)競爭等多種方式阻止外來菌群的定殖，有效維持腸道微生物群的動態(tài)平衡，預(yù)防疾病的發(fā)生。因此，腸道微生物群對宿主的營養(yǎng)、免疫等方面均發(fā)揮著重要作用[7-9]。有研究指出，腸道菌群與宿主內(nèi)分泌系統(tǒng)間的相互作用能夠明顯影響宿主的行為和生理活動[10-11]。

水產(chǎn)動物屬低等動物，容易受水環(huán)境、養(yǎng)殖工藝、地理位置等外界因子的影響，造成自身的不穩(wěn)定性，形成明顯的個體差異，研究起來相對困難。目前，對水產(chǎn)動物腸道菌群的研究主要集中于菌群結(jié)構(gòu)、主要影響因素及益生菌調(diào)控等方面[12-16]。研究表明，營養(yǎng)水平[5,17]、生理階段[18]、藥物[19-20]及外界環(huán)境脅迫[21]等均能夠不同程度地改變腸道菌群的組成信息。李存玉等[22]對池塘和工廠化養(yǎng)殖褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)腸道菌群組成進行細(xì)致研究，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖模式的不同也會對腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。而針對菌群結(jié)構(gòu)在海水魚腸道中發(fā)生、發(fā)育過程的報道相對較少，主要集中在工廠化人工繁育條件下的鲆鰈類[23-24]。在靈長類的研究中，有報道指出，相對于飲食而言，由演化趨勢形成的宿主本身的差異才是影響腸道菌群的主要因素[25]。同樣，魚種類的不同，其腸道菌群結(jié)構(gòu)也存在顯著差異，而其仔、稚魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成過程也必然不同。

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)因其生長快、抗病性強、營養(yǎng)價值較高等優(yōu)點迅速成為我國沿海各省海水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟魚種之一[26]。近幾年，其苗種繁育技術(shù)也得到相應(yīng)的完善，以確保下游產(chǎn)業(yè)鏈的可持續(xù)發(fā)展。筆者運用16S rDNA高通量測序的方法，針對苗種繁育期的許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)開展分析，并揭示早期苗種發(fā)育階段腸道的核心菌群及其定殖規(guī)律，為許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚益生菌的篩選及腸道菌群調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚的培育

將同一批受精卵孵化的許氏平鲉仔魚隨機分布于5.0 m×5.0 m×1.0 m的育苗池中，隨機挑選3個育苗池作為平行組。試驗期間育苗池嚴(yán)格按照試驗車間的操作規(guī)范進行，其中，水溫18～20 ℃，溶解氧>5 mg/L，鹽度30，氨氮質(zhì)量濃度<0.1 mg/L。

試驗用仔魚在3日齡開口，之后開始添加褶皺臂尾輪蟲(Branchionusplicatilis)。3～15日齡投喂輪蟲，12～45日齡投喂中國鹵蟲(Artemiasinica)無節(jié)幼體，40日齡開始逐漸添加配合飼料，隨著幼魚的生長，逐漸更換配合飼料的規(guī)格。

1.2 樣品采集

依據(jù)文獻[27-28]關(guān)于仔魚、稚魚、幼魚階段的劃分方法，分別對體表無任何病癥的健康的1日齡仔魚、9日齡稚魚、20日齡稚魚、54日齡幼魚、95日齡幼魚進行樣本采集，作為試驗用魚。其中，在1日齡和9日齡時，分別自每個育苗池采集50尾仔魚及稚魚，20日齡時分別采集30尾，54日齡時分別采集10尾，而95日齡時則分別采集5尾。將選取的仔魚、稚魚、幼魚進行12 h的饑餓處理，之后于滅菌海水中浸泡20 min，連續(xù)處理3次，消除體表微生物的污染。采用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(Fluka, USA)麻醉，用75%酒精擦拭體表，于無菌環(huán)境下解剖并取出腸道，去除內(nèi)容物后用預(yù)冷的無菌生理鹽水沖洗，并于液氮中保存?zhèn)溆?。由?日齡仔魚腸道分化不明顯，因此將整個仔魚用于后續(xù)腸道微生物群研究。

以G1、G9、G20、G54、G95表示不同日齡仔魚、稚魚、幼魚腸道樣品，而G1.1、G1.2、G1.3則分別代表G1組中的3個平行，其余日齡腸道樣品組同。

另從養(yǎng)殖場周圍海域收集3尾野生許氏平鲉，體質(zhì)量為(205±32) g，分別記以WG1、WG2、WG3。同樣，野生個體經(jīng)過12 h的饑餓處理與麻醉后無菌解剖取其腸道，后續(xù)處理同仔稚魚腸道樣品。

1.3 微生物總DNA提取與測序

將液氮保存的仔稚幼魚腸道樣品取出，冰上自然解凍，按照QIAamp DNA mini kit(QIAGEN, Germany)試劑盒的說明書提取微生物總DNA。PCR擴增16S rDNA的V3～V4可變區(qū)序列，擴增基因的引物為343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和798R(3′-AGGGTATCTAATCCT-5′)。擴增的序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后交由商業(yè)測序公司通過Illumina MiSeq PE300平臺進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

測序所得的下機數(shù)據(jù)，采用Trimmomatic(v 0.35)[29]剪切、Flash(v 1.2.11)[30]拼接、Uchime(v 4.2)[31]去嵌合體等一系列處理得到有效序列。然后，采用Vsearch(v 2.4.2)[32]對所有樣品的全部有效序列進行歸類操作，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為運算分類單元，并選取運算分類單元的代表性序列。用RDP Classifer(v 2.2)[33]與Silva數(shù)據(jù)庫(v 123)[34]對運算分類單元代表序列進行物種注釋。

采取單因素方差分析方法比較各時期樣品菌群結(jié)構(gòu)間的差異，顯著性水平為0.05。所有數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 測序結(jié)果

將下機所得測序數(shù)據(jù)經(jīng)過剪切、拼接、進一步質(zhì)控、去嵌合體等一系列處理后，試驗樣品總共獲得385 205條有效序列，經(jīng)聚類分析得到1039個運算分類單元，注釋后獲得667個屬。仔魚及稚魚生長發(fā)育階段腸道微生物測序結(jié)果的統(tǒng)計分析見表1，1日齡的初孵仔魚體內(nèi)屬水平的微生物種類為138.0，隨仔魚生長出現(xiàn)先降后升趨勢，并在54日齡(155.0)時出現(xiàn)最高值，而在95日齡時急劇下降。

2.2 仔魚、稚魚、幼魚腸道菌群分布規(guī)律

對生長發(fā)育階段仔魚、稚魚、幼魚及野生個體腸道中相對豐度高于1%的菌群進行對比分析，發(fā)現(xiàn)初孵仔魚腸道中豐度高于1%的菌群豐度之和為81.4%(圖1)。在整個追蹤過程中，這一豐度和呈下降—上升—下降趨勢，在95日齡時出現(xiàn)最低值(62.0%)。而在野生個體的腸道中，相對豐度高于1%的菌屬豐度之和的平均值為86%，遠高于54日齡和95日齡幼魚的平均值(73.5%)。此外，不動桿菌屬(Acinetobacter)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Massilia和Limnobacter始終存在于仔魚、稚魚、幼魚腸道內(nèi)，并且不動桿菌是仔魚、稚魚、幼魚腸道中的優(yōu)勢菌屬，其豐度為26.2%～45.3%。而野生個體腸道中則無共有的優(yōu)勢菌屬。

在不同樣本腸道微生物群的主成分分析中，主成分1和主成分2的貢獻率分別為60.1%和20.2%(圖2)。由此可見，相對于野生個體，許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚腸道樣品分布相對聚集，表明菌群組成較為相近；而對不同日齡仔魚、稚魚、幼魚來說，54日齡魚腸道菌群分布與1日齡的最相近。

2.3 仔魚、稚魚、幼魚腸道核心菌群

以各取樣點3個平行樣本共有菌屬為基礎(chǔ)，將不同生長階段的仔魚、稚魚、幼魚腸道菌群在屬水平上的共有情況進行分析，隨著魚體增長，各取樣點腸道特有菌屬數(shù)目分別為8、7、5、34、8(圖3)，5個階段中每相鄰兩階段的共有菌屬分別為46、48、48、53，而整個試驗周期內(nèi)魚腸道的共有菌群為36個，說明在整個追蹤時期這36個菌屬始終存在于仔魚、稚魚、幼魚腸道內(nèi)。

在這36個共有屬中，相對豐度高于1%的菌屬有芽孢桿菌屬(Bacillus)、短芽孢桿菌屬、根瘤菌屬(Rhizobium)、鞘氨醇單胞菌屬、貪銅菌屬(Cupriavidus)、Massilia、Limnobacter、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、弧菌屬(Vibrio)、不動桿菌屬。將這11個菌屬作為仔稚幼魚腸道的核心菌群，并對其豐度隨魚體生長發(fā)育的變化趨勢進行分析(圖4)。由于1日齡的初孵仔魚腸道未分化，研究過程采用的是整個魚體，因此在對核心菌群分析時自9日齡開始。其中，芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、貪銅菌屬、Massilia和寡養(yǎng)單胞菌屬的豐度隨仔魚、稚魚、幼魚生長整體呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這8個菌屬均在54日齡時出現(xiàn)最高值，分別為1.42%、13.59%、45.28%、1.26%、2.79%、0.93%、8.29%、8.99%；弧菌屬則為先逐漸下降后迅速上升的趨勢(0.37%～12.41%)，54日齡時豐度最低；Limnobacter和假交替單胞菌屬整體則呈現(xiàn)下降趨勢。同時，在這些核心菌群的演變趨勢中，芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和弧菌屬的豐度變化較為明顯。

表1 苗種繁育階段許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚腸道微生物測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(n=3)Tab.1 Statistics of sequencing data for microflora in intestines of black rockfish during the early life stage

圖1 許氏平鲉苗種繁育早期仔魚、稚魚、幼魚與野生魚體腸道中相對豐度大于1%的菌屬Fig.1 The composition of genera with abundance higher than 1% in intestines of larval and juvenile and wild black rockfish

圖2 許氏平鲉腸道中微生物群的主成分分析Fig.2 The principal components analysis (PCA) of microbiota in intestines of black rockfish larva and juvenile

圖3 許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚腸道共有微生物群分析Fig.3 The analysis of shared microbiota among black rockfish larva and juvenile intestines

2.4 人工繁育仔魚、稚魚、幼魚腸道與野生個體腸道微生物群的共有菌群分析

14個菌群既存在于人工繁育仔魚、稚魚、幼魚腸道(表2)，又存在于野生個體腸道中，表明這些菌群可能一直存在于許氏平鲉的腸道內(nèi)。在這些菌群中，不動桿菌屬、芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、Massilia、根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和弧菌屬為仔魚、稚魚、幼魚腸道的核心菌群；同時，不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬也是野生個體中相對豐度大于1%的屬。另外，仔魚、稚魚、幼魚腸道中短芽孢桿菌屬、Massilia的最小豐度值分別是野生個體腸道中最大豐度值的9倍、32倍，差異較大。但是，核心菌群中的Limnobacter和假交替單胞菌屬卻不存在于野生個體中。

圖4 許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚生長過程中腸道核心菌群相對豐度的變化規(guī)律Fig.4 Changes in relative abundance of core microbiota in intestines of black rockfish larva and juvenile during the developmental stage

表2許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚腸道與野生個體腸道共有菌群%

Tab.2 Shared microbiota in intestines of larva and juvenile and wild black rockfish

3 討 論

3.1 許氏平鲉腸道微生物群結(jié)構(gòu)分析

初孵仔魚未開口不能攝食，因此養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物對其影響較小，1日齡仔魚體內(nèi)微生物主要來自于親本或受精過程的環(huán)境微生物。而輪蟲、鹵蟲是營養(yǎng)物質(zhì)、微生物等的天然生物載體，其體內(nèi)攜帶大量微生物。并且，輪蟲、鹵蟲這類的鮮活生物餌料在海水魚苗種繁育早期一般是現(xiàn)營養(yǎng)強化現(xiàn)用，尤其是輪蟲，一般是現(xiàn)用現(xiàn)買，每批次的微生物品質(zhì)不能保證完全一致。因此，不同批次的生物餌料，其攜帶的微生物組成都會存在一定的差異。而健康苗種腸道內(nèi)的微生物群維持在動態(tài)的平衡中，仔魚、稚魚攝食輪蟲后其腸道內(nèi)的定殖微生物群與餌料中的菌群之間存在一定的競爭，包括黏附位點競爭、營養(yǎng)競爭等。通過這些競爭作用，外源微生物難以在腸道中定殖而被排出體外；同時，受微生物間相互作用的影響，腸道內(nèi)的微生物群結(jié)構(gòu)發(fā)生一定轉(zhuǎn)變，從而表現(xiàn)出與1日齡的初孵仔魚相比，9日齡稚魚腸道微生物屬水平物種數(shù)目及相對豐度高于1%的屬的豐度之和出現(xiàn)一定的波動。鹵蟲體內(nèi)雖然也攜帶大量微生物，但是與輪蟲的明顯不同[23,35]。因此，隨著鹵蟲的逐漸添加，魚腸道菌群結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生改變。鹵蟲投喂時間相對較長(12～45日齡)，40日齡后開始添加配合飼料，在54日齡和95日齡完全配合飼料期，腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化仍然比較大。并且，在54日齡時幼魚腸道的特有菌屬明顯比其他時期的多。推測可能是由于生物餌料對仔魚、稚魚、幼魚腸道菌群的影響具有一定的持續(xù)性，再加上隨魚生長其生理功能在不斷完善，腸道對內(nèi)部菌群逐漸形成一定的選擇性造成的。但是，隨著幼魚對配合飼料的不斷攝入，95日齡時腸道的特有菌屬又明顯下降；同時，54日齡和95日齡腸道的共有菌屬明顯升高。這也反映出幼魚腸道微生物群對配合飼料的逐漸適應(yīng)及其腸道菌群組成逐漸穩(wěn)定。

人工繁育仔稚幼魚腸道中相對豐度高于1%的菌屬與野生個體中的差異較大；同時，不同時期的仔魚、稚魚、幼魚腸道共有菌群36個，而與野生個體腸道僅有14個共有菌屬；并且，短芽孢桿菌屬、Massilia在仔魚、稚魚腸道中的最小豐度值分別是野生個體腸道中最大豐度值的9倍、32倍，說明生存環(huán)境是許氏平鲉腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的一個重要因素[36]。在不同餌料階段核心菌群中的芽孢桿菌屬、不動桿菌屬和弧菌屬等的豐度變化比較明顯，反映出餌料對仔魚、稚魚、幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)具有一定的影響。研究表明，飼料組分的變化能夠影響魚體腸道微生物群的組成、分布及豐度等特征[37-39]。也有報道[15,35,40]指出，人為添加微生物(益生菌)可以改變甚至優(yōu)化宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)。但Bakke等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過餌料進行微生物的添加對大西洋鱈(Gadusmorhua)幼魚腸道微生物群結(jié)構(gòu)的影響較小，這可能與試驗魚的種類、生理階段及試驗條件的設(shè)計有關(guān)。

3.2 許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚腸道核心菌群分析

本研究中，1日齡的初孵仔魚體內(nèi)弧菌含量為0.37%，開口攝食生物餌料后，在9日齡時其豐度迅速增加并成為優(yōu)勢菌屬。但是，試驗用仔魚、稚魚、幼魚均為體表、腸道正常并無任何生理學(xué)病征的健康仔魚、稚魚、幼魚，這與對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、褐牙鲆、庸鰈(Hippoglossushippoglossus)的仔魚、稚魚開口前后腸道中弧菌屬豐度的變化規(guī)律相似[23-24,41]。但是，在仔魚、稚魚、幼魚攝食生物餌料后的整個苗種繁育過程中，弧菌屬的演替規(guī)律為先降后升；并且，許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚腸道中最優(yōu)勢的菌屬并不是弧菌，而是不動桿菌屬。此外，不動桿菌屬及其他大部分的核心菌群在許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚發(fā)育過程中整體呈先升后降趨勢，并在54日齡時豐度最高。這也是與鲆鰈類明顯不同的地方。值得一提的是，本研究中，仔魚、稚魚、幼魚核心菌群中弧菌屬的豐度變化趨勢與不動桿菌屬的完全相反?？赡苁嵌咴谧恤~、稚魚、幼魚腸道中存在某種嚴(yán)格的競爭形成的，也有可能是多種菌群間競爭共同存在導(dǎo)致的。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，弧菌是弧菌病的重要病原菌，哈維氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)是其中具有代表性的3種弧菌[42-44]。也有研究指出在正常的生物餌料及健康的海水魚腸道中弧菌也是正常存在的[35,45-47]。同時，本研究中仔魚、稚魚、幼魚腸道中的優(yōu)勢菌屬不動桿菌屬，在醫(yī)學(xué)界是備受關(guān)注的一類微生物，能夠?qū)θ祟愒斐芍旅膫48-49]。目前，已從養(yǎng)殖魚類中分離鑒定的致病不動桿菌包括鮑曼不動桿菌(A.baumannii)、洛菲不動桿菌(A.lwoffii)、正約氏不動桿菌(A.johnsonii)、A.pittii等，并且具有一定的耐藥性[39,50-51]。可見，苗種繁育階段，有害菌群就已定殖于健康仔魚、稚魚、幼魚腸道中，并且豐度較高。如果仔魚、稚魚、幼魚生長過程受到某種因素的脅迫，極易導(dǎo)致腸道菌群失衡，使有害菌群大量繁殖，并且仔魚、稚魚、幼魚自身的免疫機能尚未發(fā)育完善，這可能也是育苗過程中病害常發(fā)的主要原因之一。

另外，仔魚、稚魚、幼魚腸道核心菌群中同樣也存在著芽孢桿菌、短芽孢桿菌等，這類菌群在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被用作益生菌[52-55]。益生菌的存在，與腸道中的病原菌形成各種競爭，直接或間接相互抑制，使腸道菌群處于平衡狀態(tài)。明確益生菌類群的存在后，可以有針對性的對許氏平鲉仔魚、稚魚、幼魚“土著”益生菌進行分離培養(yǎng)，并對苗種繁育階段的仔魚、稚魚、幼魚腸道菌群進行調(diào)控，使其維持在理想的動態(tài)平衡中，促進苗種的健康培育，這也是筆者今后研究工作的重點。