吳慧芳 ，羅國芝,2,3，譚洪新,2,3，蒙浩焱

( 1.上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心， 上海 201306； 3.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306 )

隨著人們對水產(chǎn)品需求的不斷增長，海水養(yǎng)殖迅猛發(fā)展[1]，取得了較高經(jīng)濟產(chǎn)值，也帶來了環(huán)境污染等問題。生物絮凝技術(shù)是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的環(huán)境污染和降低飼料成本的有效替代技術(shù)[2]。該技術(shù)是基于城市污水處理的活性污泥法，利用細菌的同化將養(yǎng)殖水體的顆粒有機物、溶解有機物和無機氮轉(zhuǎn)化為細菌生物量的處理技術(shù)，主要通過調(diào)控養(yǎng)殖水體的碳氮比、溶解氧、pH等建立絮凝劑所適宜的生長環(huán)境，將有機廢物同化為微生物[3-4]。該技術(shù)可應(yīng)用在封閉式循環(huán)水養(yǎng)殖模式，以減少投喂量和養(yǎng)殖尾水的排放，降低周邊水域環(huán)境污染。

相對于淡水生物絮凝系統(tǒng)，海水生物絮凝系統(tǒng)主要受鹽度的影響。鹽度使絮團成熟的時間明顯滯后，一般淡水生物絮團成熟需約1個月時間[5]，而高鹽度的海水生物絮團培養(yǎng)往往需要約2個月時間[6]，所需時間比淡水長。面對高鹽環(huán)境，微生物會出現(xiàn)單細胞聚集以及內(nèi)源性呼吸加速的現(xiàn)象，通過分泌和細胞自溶釋放細胞有機組成成分，嚴(yán)重影響其生理功能[7-9]。在海水生物絮團培養(yǎng)期間，常出現(xiàn)亞硝酸鹽氮累積現(xiàn)象[10-12]。在好氧顆粒序批式反應(yīng)器中，Cl-由0.2 g/L逐漸增至20 g/L時，對氨氧化進程無明顯作用，但明顯抑制亞硝酸鹽氮氧化進程[13]。面對海水生物絮團培養(yǎng)過程中鹽脅迫造成的培養(yǎng)時間過長，尤其是亞硝酸鹽氮長期積累的現(xiàn)象，需探索出合理的鹽度調(diào)節(jié)方式，以縮短海水生物絮團的培養(yǎng)周期。

面對鹽度造成海水生物絮團構(gòu)建耗時較長的問題，筆者采取了3種不同的鹽度調(diào)節(jié)方式構(gòu)建海水養(yǎng)殖生物絮凝系統(tǒng)，首先采用了鹽度直接調(diào)節(jié)的方式和鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式培養(yǎng)生物絮凝系統(tǒng)，其次由于淡水生物絮團構(gòu)建時間明顯較海水生物絮團構(gòu)建所需時間短，故以先培養(yǎng)淡水生物絮團，再緩慢調(diào)節(jié)鹽度馴化成海水絮團的淡水馴化的方式培養(yǎng)生物絮凝系統(tǒng)，旨在探索出海水生物絮團培養(yǎng)的最佳鹽添加策略，以縮短培養(yǎng)周期。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置及材料

本試驗共用9個容積為100 L的圓柱形養(yǎng)殖水桶，每3個桶用兩臺充氣泵。培養(yǎng)絮體所用的原料為鰻魚飼料(水分≤10.0%，粗蛋白≥48.0%，賴氨酸≥2.5%，粗脂肪≥4.0%，粗纖維≤3.0%，粗灰分≤17.0%，1.0%≥總磷≥2.8%)。

1.2 試驗設(shè)計

將9個桶分為鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組，每組設(shè)3個平行，每個桶加70 L自來水，曝氣3 d后每個桶加35 g鰻魚飼料，將溫度控制在約25 ℃，隨后進行3組鹽度30的生物絮凝系統(tǒng)的啟動，試驗進行到3個系統(tǒng)成熟為止。鹽度直接調(diào)節(jié)組是試驗初期一次性直接加鹽使鹽度為30，悶曝(絮體培養(yǎng)前3 d悶曝72 h：曝氣8 h、停止曝氣16 h，依次循環(huán)3 d為止)結(jié)束后進行絮體培養(yǎng)。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組是悶曝結(jié)束后，每日鹽度增加5(9：00開始，每隔3 h增加1)，至鹽度30為止。淡水馴化組是在悶曝后先進行淡水絮體培養(yǎng)，待淡水絮體培養(yǎng)好后，按鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的方式調(diào)控鹽度。生物絮團啟動階段，通過添加碳酸氫鈉使堿度保持在約250 mg/L(以碳酸鈣計)[14]，用葡萄糖(古阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古)補充所需碳源，使碳氮比(氮為氨氮形式)為15，通過測鹽度來添加因蒸發(fā)而損失的水分。啟動完成后，監(jiān)測3個處理組對10 mg/L的氨氮(10 mg/L的氨氮采用每升絮體中加3.82 mg氯化銨來調(diào)控)的去除效果。

1.3 試驗指標(biāo)與測定方法

1.3.1 水質(zhì)指標(biāo)的測定

每隔1 d檢測水體的溫度、pH、溶解氧(WTW Multi 3430，德國)并測定總氮、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、溶解性有機碳和堿度[15]?？偟捎眠^硫酸鉀氧化—紫外分光光度法(型號UV20上海尤尼柯)測定。水樣經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾后測定三態(tài)氮及溶解性有機碳，其中亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和氨氮含量分別采用重氮—偶氮法、鋅鎘還原法和次溴酸鈉氧化法測定，溶解性有機碳含量使用多功能碳氮比分析儀(Multi N/C 2100，德國)測定,堿度采用酸堿滴定指示法測定。

1.3.2 絮體成分指標(biāo)的測定

每20 d進行生物絮體指標(biāo)測定。總固體懸浮顆粒物采用稱量質(zhì)量法測定，5 min和15 min的絮體沉降體積用英霍夫式錐形管測定。

1.3.3 生物絮體微生物樣品的采集與測序

生物絮體菌樣的采集：鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在75 d取樣，淡水馴化組在75 d和39 d分別取樣。每次取50 mL水樣經(jīng)0.22 μm的濾膜抽濾后，冰箱-80 ℃保存，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，用Excel 軟件統(tǒng)計結(jié)果并繪制相關(guān)圖表。用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用 LSD 進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)系統(tǒng)啟動階段

2.1.1 三態(tài)氮的動態(tài)變化

試驗期間，3個處理組中pH、溶解氧、溫度、溶解性有機碳等水質(zhì)指標(biāo)見表1，均無顯著性差異(P>0.05)。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組的堿度均值分別為(250.18±27.74) mg/L、(224.40±20.07) mg/L和(188.19±54.54) mg/L，有明顯差異(P<0.05)，淡水馴化組堿度明顯低于其他兩組。

表1 啟動階段3個處理組中各水質(zhì)指標(biāo)的平均值、最小值和最大值Tab.1 Mean，min and max values of water quality parameters in three different treatment groups during start-up phase

(續(xù)表1)

指標(biāo)Index組別 Group直接鹽度調(diào)節(jié)組Direct salinity regulation group鹽度緩慢調(diào)節(jié)組Salinity slowly regulated group淡水馴化組Freshwater domestication group亞硝酸鹽氮/mg·L-1NO2--N平均值 Mean11.97±13.93a4.97±5.99b3.67±6.54b最大值 Max34.17±2.3516.33±0.4622.83±0.85最小值 Min0.01±0.010.02±0.000.01±0.01硝酸鹽氮/mg·L-1NO3--N平均值 Mean9.19±13.92b13.82±0.14.68ab19.72±16.77a最大值 Max38.22±1.2338.99±0.2440.54±0.71最小值 Min0.00±0.000.00±0.000.00±0.00總氨氮/mg·L-1NH4+-N平均值 Mean2.76±3.83a2.67±4.16a2.81±4.47a最大值 Max10.83±1.5315.16±1.4517.89±2.74最小值 Min0.01±0.000.00±0.000.00±0.00總氮/mg·L-1TN平均值 Mean57.01±3.00a55.01±4.14a58.50±5.43a最大值 Max62.34±0.5567.08±0.9967.67±3.64最小值 Min49.38±1.1947.83±0.6147.87±0.46溶解性有機碳/mg·L-1DOC平均值 Mean22.29±8.47a19.25±7.14a20.54±6.84a最大值 Max45.38±2.6837.81±4.1438.89±9.14最小值 Min7.41±1.143.61±1.1310.55±2.29堿度/mg·L-1Alk平均值 Mean250.18±27.74a224.40±20.07b188.19±54.54c最大值 Max281.67± 1.11261.66±9.63264.80±5.08最小值 Min194.97±5.87181.42±5.4781.59±6.39

注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同字母的平均值間存在顯著差異(P<0.05).

Note: means with different superscripts in the same line are significantly different (P<0.05).

3個處理組中，三態(tài)氮和總氮含量隨鹽度添加方式的動態(tài)變化見圖1。3個處理組中氨氮含量的變化無顯著差異(P>0.05)，均先升后降，其中鹽度直接調(diào)節(jié)組氨氮含量在第9 d達峰值(10.83±1.53) mg/L，第39 d降至(0.01±0.00) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第9 d達峰值(15.16±1.45) mg/L，第19 d降至(0.30±0.36) mg/L；淡水馴化組在第5 d達到峰值(17.90±2.74) mg/L，第23 d降至(0.45±0.26) mg/L(圖1a)。雖然淡水馴化組氨氮含量先升高至峰值，但鹽度緩慢調(diào)節(jié)組先于鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水馴化組降至低含量水平。后期淡水馴化組氨氮含量有所波動，第55 d時升至(1.18±0.87) mg/L。3個處理組中亞硝酸鹽氮的變化趨勢隨氨氮含量的降低均先升后降(圖1b)。其中鹽度緩慢調(diào)節(jié)組分別在第13、17 d開始上升，鹽度直接調(diào)節(jié)組第23 d才開始上升。鹽度直接調(diào)節(jié)組亞硝酸鹽氮含量峰值達(34.17±2.35) mg/L，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組峰值分別為(16.33±0.45) mg/L、(22.83±0.85) mg/L，鹽度直接調(diào)節(jié)組峰值顯著高于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組兩組(P<0.05)。雖然鹽度緩慢調(diào)節(jié)組亞硝酸鹽氮含量先升高，但淡水馴化組先于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第37 d降至(0.20±0.14) mg/L，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第49 d時降至(0.10±0.06) mg/L，鹽度直接調(diào)節(jié)組直到63 d時降至(0.02±0.01) mg/L。后期除淡水馴化組亞硝酸鹽氮含量在57 d升至(4.04±0.31) mg/L，有所波動外，3個處理組亞硝酸鹽氮含量均低于0.50 mg/L。3個處理組中硝酸鹽氮含量的變化總趨勢是先維持較低含量水平，后期逐漸升高(圖1c)。淡水馴化組在25 d時開始上升，在41 d時達到(37.99±1.57) mg/L，鹽度直接調(diào)節(jié)組硝酸鹽氮含量的變化與淡水馴化組有顯著差異(P<0.05)，第49 d時才開始上升，第61 d達到(34.75±0.54) mg/L。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組硝酸鹽氮含量變化與鹽度直接調(diào)節(jié)組、淡水馴化組無顯著差異(P>0.05)，第33 d開始上升，在55 d達到(30.94±0.85) mg/L。3個處理組中總氮含量差異不顯著(P>0.05)，在(47.83±0.61) mg/L和(67.67±3.64) mg/L之間波動(圖1d)。

圖1 3個處理組中氨氮(a)、亞硝酸鹽氮(b)、硝酸鹽氮(c)及總氮(d)的動態(tài)變化Fig.1 Dynamics of total ammonia-N(a), nitrite-N(b), nitrate-N(c) and total nitrogen(d) in the three different groups

2.1.2 絮體沉降體積與總固體懸浮物含量

3個處理組中5 min的絮體沉降體積波動幅度較大且差異顯著(P<0.05)。鹽度直接調(diào)節(jié)組第7 d 時，5 min的絮體沉降體積達到最大值(60.00±0.00) mL/L，第9 d開始降至(0.00±0.00) mL/L，第43 d開始上升，至最高值(12.33±1.25) mL/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組5 min的絮體沉降體積在前57 d先上升后，維持在40.00～65.00 mL/L，在第59 d時突降至(0.00±0.00) mL/L，而第65 d時又升至(80.67±14.82) mL/L，最后維持在約60.00 mL/L；淡水馴化組5 min的絮體沉降體積先升高，第15 d達到最大值(106.67±36.82) mL/L，后又降低，在第47 d時降至(2.00±0.00) mL/L，后期在(6.00±1.63) mL/L至(44.00±9.09) mL/L之間波動(圖2a)。3個處理組15 min的絮體沉降體積變化趨勢中，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組較為一致，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩調(diào)節(jié)組差異顯著(P<0.05)。其中鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水馴化組15 min的絮體沉降體積先升高，分別在第19 d和13 d達峰值(103.33±1.63) mL/L和(76.67±12.47) mL/L，后逐漸降低，分別在第45 d和47 d后維持在2.00～18.00 mL/L和18.00～53.00 mL/L。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組試驗期間15 min的絮體沉降體積變化不大，自試驗開始后升至(30.33±5.56) mL/L，維持在30.00～50.00 mL/L，試驗后期稍上升，但上升幅度不大(圖2b)。

鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組總固體懸浮顆粒物含量變化一致，無明顯差別(P>0.05)，其中鹽度直接調(diào)節(jié)組總固體懸浮顆粒物含量為1400～2000 mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組總固體懸浮顆粒物含量為950～2000 mg/L；淡水馴化組總固體懸浮顆粒物含量先維持在350～550 mg/L，后迅速升至1300～1800 mg/L，較鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

2.1.3 3個處理組生物絮凝系統(tǒng)中微生物多樣性

對3個處理組淡水組(淡水馴化組前期淡水啟動完成組)和海水啟動完成組(鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組)4組生物絮團進行了以下方面的多樣性分析。

2.1.3.1 微生物多樣性及豐度

對樣本序列在97 %的相似水平下進行聚類分析，得到微生物運算分類單元水平的物種韋恩圖(圖4)。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組、淡水組中運算分類單元分別為421、459、505和436個，4組共有的運算分類單元為93個，占4組總數(shù)的11.44%，鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組共有的運算分類單元為256個，占3組總數(shù)的44.83%，淡水組獨有的運算分類單元為242個，占淡水組的55.51%，淡水組和淡水馴化組共有的運算分類單元為62個，明顯較淡水組和鹽度直接調(diào)節(jié)組以及淡水組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組共有的運算分類單元多(淡水組與鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水組與鹽度緩慢調(diào)節(jié)組分別共有的運算分類單元分別為4個和9個)。上述試驗結(jié)果表明，鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組的物種運算分類單元無明顯差異，但是，淡水組與其他3組運算分類單元有顯著性差異。

圖2 3個處理組中絮體沉降體積5 min(a)和15 min(b)的動態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes in flocs volume of FV-5 min(a) and FV-15 min(b) in the three different groups

圖3 3個處理組中總固體懸浮物含量的動態(tài)變化Fig.3 Dynamics of total suspended solids in the three different groups

圖4 3個處理組的物種韋恩圖Fig.4 Species Venn diagram of the three different groups

通過對單樣本的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的多樣性和豐度。反映群落多樣性的常用指數(shù)有：香農(nóng)指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)值越大，群落多樣性越高)和辛普森指數(shù)(辛普森指數(shù)值越大，群落多樣性越低)。反映群落豐度的常用指數(shù)有Chao和Ace指數(shù)。除淡水組多樣性略高于其他3組，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組多樣性無明顯差異；結(jié)合各組的運算分類單元值，以及Chao、Ace指數(shù)，發(fā)現(xiàn)鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水組微生物物種的豐度均低于淡水馴化組(表2)。

2.1.3.2 微生物門水平和綱水平的群落結(jié)構(gòu)

在門水平上，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的主要優(yōu)勢菌群為擬桿菌門和變形菌門，前者占鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組菌群的37.77%和38.77%，后者占27.34%和27.23%，放線菌門豐度也較高，分別占鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的15.18%和14.55%；放線菌門為淡水馴化組和淡水組的主要優(yōu)勢菌群，豐度分別為33.22%和 34.18%。除放線菌門外，淡水馴化組主要優(yōu)勢菌群還有擬桿菌門和變形菌門，豐度分別為36.37%和17.51%，淡水組主要優(yōu)勢菌群還有變形菌門，豐度占淡水組菌群的40.71%(圖5a)。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組擬桿菌門的豐度明顯高于淡水組(P<0.05)，淡水馴化組、淡水組放線菌門明顯較鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組高(P<0.05)，淡水組變形菌門明顯高于其他3組(P<0.05)。綠彎菌門、浮霉菌門和Parcubacteria在4組中豐度也較高，但差異不顯著(P>0.05)(圖6a)。

表2 3個處理組物種的豐度和多樣性Tab.2 The abundance and diversity of species in three different groups

在綱水平上，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組中優(yōu)勢菌群有黃桿菌綱(其豐度分別占鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的25.13%和21.91%)、放線菌綱(15.18%、14.55%)、α-變形菌綱(14.36%、17.56%)和鞘脂桿菌綱(11.25%、15.69%)，其中γ-變形菌綱和暖繩菌綱豐度也較高；淡水馴化組主要優(yōu)勢菌群有黃桿菌綱(31.69%)和放線菌綱(33.22%)(圖5b)。α-變形菌綱在淡水馴化組中也有較高豐度，占12.12%；淡水組主要優(yōu)勢菌綱為放線菌綱(34.18%)和α-變形菌綱(27.05%)，此外γ-變形菌綱和暖繩菌綱在淡水組中豐度所占比例也較高(圖5b)。淡水馴化組、淡水組中放線菌綱豐度明顯較鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組高(P<0.05)，淡水組黃桿菌綱和α-變形菌綱豐度與其他3組有明顯差異(P<0.05)，淡水組γ-變形菌綱和暖繩菌綱的豐度明顯較淡水馴化組高(圖6b)。

圖5 3個處理組優(yōu)勢菌群在門水平(a)和綱水平(b)上的分布Fig.5 Predominant bacterial community at phylum level(a)and class level(b)in the three different groups

圖6 3個處理組中優(yōu)勢菌群在門水平(a)和綱水平(b)分布的差異性Fig.6 The differences in predominant bacterial community at phylum level(a) and class level(b) in the three different groups

2.1.3.3 微生物屬水平上物種的組成

對4組樣本的菌群進行了群落屬水平物種組成heatmap圖和樣本聚類樹分析(圖7)。淡水組優(yōu)勢菌屬與鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組優(yōu)勢菌屬組成存在顯著差異，而鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組3組優(yōu)勢菌屬組成及豐度差異不顯著。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組的主要優(yōu)勢菌屬為Leptobactrium(在鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組中豐度分別占27.00%、24.00%和34.00%，)、norank_f_Segniliparacea(9.00%、13.00%、32.00%)、Amaricoccus(4.00%、9.00%和7.00%，)，鹽度直接調(diào)節(jié)組優(yōu)勢菌屬還有norank_f_Saprospiraceae(10.00%)、norank_f_Caldilineaceae(6.00%)、副球菌屬(Paracoccus)(5.00%)、紅球菌屬(Rhodococcus)(5.00%)，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組優(yōu)勢菌屬還有Phaeodactylibacter(9.00%)和Norank_f_Anaerolineaceae(5.00%)；淡水組優(yōu)勢菌屬主要有中村氏菌屬(Nabamurella)(18.00%)、norank_f_Caldilineaceae(12.00%)、norank_f_Segniliparacea(10%)、Woodsholea(9.00%)、溶桿菌屬(Lysobacter)(8.00%)、劍菌屬(Ensifer)(6.00%)、副球菌屬(6.00%)、Paenarthrobacter(5.00%)。

2.2 啟動完成后氨氮的轉(zhuǎn)化效果

在10 mg/L的氨氮處理過程中，3組氨氮含量逐漸降低后，維持在低含量水平，3組間無顯著性差異(P>0.05)(圖8a)。其中鹽度直接調(diào)節(jié)組最先在5 h時降至(0.41±0.14) mg/L，后降至低于0.04 mg/L；淡水馴化組在第6 h降至(0.33±0.06) mg/L，后降至低于0.04 mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第7 h降至0.23±0.04 mg/L，較鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水馴化組慢，后降至低于0.07 mg/L。

隨著氨氮含量的降低，3個處理組中亞硝酸鹽氮含量先升后降，其中鹽度直接調(diào)節(jié)組最先在第5 h升高至峰值(0.99±0.16) mg/L，在第9 h降至(0.05±0.01) mg/L；淡水馴化組在第6 h升至峰值(0.80±0.02) mg/L，在第12 h降至(0.05±0.01) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第6 h升至峰值(1.27±0.08) mg/L，在第13 h降至(0.03±0.04) mg/L。

圖7 物種屬水平的相對豐度Fig.7 Relative abundance of batterial clusters at genus level in the three groups

圖8 3個處理組中氨氮(a)，亞硝酸鹽氮(b)，硝酸鹽氮(c)及總氮(d)的動態(tài)變化Fig.8 Dynamics of total ammonia-N(a),nitrite-N(b),nitrate-N (c)and total nitrogen(d) in the water in the three different groups

3組間亞硝酸鹽氮的變化無顯著性差異(P>0.05)(圖8b)。

鹽度直接調(diào)節(jié)組硝酸鹽氮質(zhì)量濃度由最初的(38.69±2.30) mg/L降至最終的(36.57±2.32) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組硝酸鹽氮含量始終無明顯變化(P>0.05)(圖8c)。

3個處理組中，總氮含量均有所升高。鹽度直接調(diào)節(jié)組由(77.44±4.76) mg/L升至(82.55±2.19) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組由(86.28±5.54) mg/L升至(89.33±3.52) mg/L；淡水馴化組由(79.24±1.51) mg/L升至(81.20±2.24) mg/L。鹽度直接調(diào)節(jié)組總氮含量較高于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組(圖8d)。

3 討 論

3.1 反應(yīng)系統(tǒng)啟動階段

3.1.1 不同鹽度調(diào)節(jié)方式對生物絮凝反應(yīng)器啟動過程中水質(zhì)的影響

在采用有機糞便或飼料等培養(yǎng)生物絮凝的氮素轉(zhuǎn)化過程中，首先會發(fā)生氨化過程，即氨化細菌將含氮的飼料糞便等有機物降解為無機氨氮。從系統(tǒng)中氨氮含量的動態(tài)變化看，較淡水馴化組，培養(yǎng)初期發(fā)生的氨化過程中，鹽的添加對有機物降解為無機氨有一定的滯后作用，即鹽度可能對氨化細菌有一定的抑制作用，但是抑制效果不明顯，且初期緩慢分批增加鹽度的處理組氨氮先降至低水平，說明有可能鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式有助于氨氮的轉(zhuǎn)變；結(jié)合氨氮和亞硝酸鹽氮含量的變化，3個處理組中直接調(diào)節(jié)鹽度的方式，氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮的過程比前期不添加鹽的淡水馴化組明顯滯后，氨氧化細菌明顯被抑制；但是緩慢調(diào)節(jié)時，氨氮的抑制作用明顯減弱，甚至不存在，說明系統(tǒng)中氨氧化細菌對鹽度沖擊具有一定的緩沖能力。后期硝酸鹽氮含量的積累過程表明，鹽度明顯抑制亞硝酸鹽氮氧化過程，而直接鹽度調(diào)節(jié)的方式，抑制作用更明顯。本試驗結(jié)果與Pronk等[13]的研究結(jié)果一致，在好氧顆粒序批式反應(yīng)器中，鹽離子對氨氧化無明顯的抑制作用，但明顯抑制亞硝酸鹽氮氧化進程。

整個啟動階段中，3個處理組總氮含量無明顯變化，說明整個試驗過程中，幾乎不存在反硝化過程和外界氮氣等的固氮作用。試驗后期淡水馴化組氨氮含量有所積累，可能是系統(tǒng)中存在明顯的異養(yǎng)型細菌。后期氨氮含量很低，碳源添加減少，硝化型細菌逐漸占優(yōu)勢，氨氮不能被直接利用。結(jié)合不同添加方式中三態(tài)氮和總氮含量的動態(tài)變化，先構(gòu)建淡水生物絮團，再馴化成海水生物絮團的淡水馴化組，培養(yǎng)周期最短，較直接調(diào)節(jié)鹽度的方式縮短了約20 d，較初期緩慢分批添加鹽的方式，縮短了5～10 d，但啟動完成后，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的系統(tǒng)運行更穩(wěn)定，啟動所需時間和系統(tǒng)穩(wěn)定性看，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組更有利于海水生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。

3.1.2 不同鹽度調(diào)節(jié)方式對啟動過程中生物絮體沉降性和總固體懸浮物含量的影響

不同鹽度添加方式試驗組的生物絮團培養(yǎng)過程中，對比淡水馴化組，鹽度直接調(diào)節(jié)的方式，絮團聚積，污泥膨脹減小，嚴(yán)重影響絮體的沉降性能，而鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式，對絮團的沉降性無明顯影響。這與王淑瑩等[16-17]的研究一致，高鹽度的海水會使活性污泥中原生動物和絲狀菌逐漸減少，菌膠團變得更加密實。但是后期鹽度緩慢調(diào)節(jié)組5 min的沉降體積突然降至0.00 mg/L的原因有待于進一步探究。

由總固體懸浮顆粒物含量的動態(tài)變化可見，添加鹽會使系統(tǒng)中總固體懸浮顆粒物含量明顯升高。試驗后期在自來水中加入海水晶，當(dāng)鹽度為30時，經(jīng)濾紙過濾測其總固體懸浮顆粒物值，發(fā)現(xiàn)所測值與鹽度直接調(diào)節(jié)組(鹽度為30)和淡水馴化組前期(鹽度為0.2)總固體懸浮顆粒物的差值幾乎相等，即海水生物絮凝系統(tǒng)中鹽的添加會增加整個系統(tǒng)的總固體懸浮顆粒物含量，因此培養(yǎng)海水生物絮凝時，所需的總固體懸浮顆粒物值應(yīng)是所測實際值減去相應(yīng)海水鹽度對應(yīng)的總固體懸浮顆粒物值。

3.1.3 不同鹽度調(diào)節(jié)方式對生物絮凝系統(tǒng)啟動過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

絮團微生物高通量測序結(jié)果表明，3個處理組中，淡水組(淡水啟動完成組)絮團中微生物多樣性高于其他3組，說明鹽度30的海水環(huán)境中一部分微生物種群會受到鹽的沖擊而死亡，生物多樣性降低，而淡水馴化組微生物的豐度高于其他3組，說明淡水系統(tǒng)中某些微生物種群可能更適宜在高鹽環(huán)境中生長，隨著鹽度緩慢加入，對高鹽環(huán)境適應(yīng)后迅速生長，加之淡水啟動完成組微生物多樣性最高，緩慢加入鹽后，適宜高鹽環(huán)境的微生物豐度增加。鹽度直接調(diào)節(jié)組略低于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組，說明直接調(diào)節(jié)鹽度對微生物沖擊作用較大。這與文獻[18-20]的研究結(jié)果一致。

對微生物門水平的分析發(fā)現(xiàn)，高鹽環(huán)境有利于擬桿菌門細菌的生長，但抑制了變形菌門細菌的生長。系統(tǒng)中若存在較高豐度的放線菌門細菌，鹽度緩慢增加對放線菌門細菌無抑制作用，但系統(tǒng)中放線菌門細菌豐度很低時，增加鹽度會抑制放線菌門細菌的生長。對微生物綱水平的分析發(fā)現(xiàn)，鹽度有利于黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱細菌的生長，但抑制了α-變形菌綱細菌的生長，對放線菌綱細菌的影響同其對放線菌門細菌的影響。對微生物屬水平的分析表明，Leptobactrium是海水生物絮凝系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群，不受鹽調(diào)節(jié)方式的影響，只要系統(tǒng)中存在鹽度，就會刺激Leptobactrium的生長，該菌屬黃桿菌科，占海洋細菌的33.3%[21]。添加鹽后系統(tǒng)中norank_f_Segniliparacea的豐度明顯升高，說明將淡水生物絮凝馴化成海水生物絮凝時刺激了norank_f_Segniliparacea的生長。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組Phaeodactylibacter的豐度明顯高于其他3組。安治武[22]在研究微生物制劑對養(yǎng)殖水體的凈化效果時發(fā)現(xiàn)，Phaeodactylibacter是將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的優(yōu)勢硝化細菌，其豐度占13.69%。對微生物的分析發(fā)現(xiàn)，鹽度調(diào)節(jié)方式對微生物豐度有一定影響，但是對微生物群落結(jié)構(gòu)無明顯影響，故3種鹽度的調(diào)節(jié)方式均可用于生物絮團的構(gòu)建。

3.2 啟動完成后不同鹽調(diào)節(jié)方式下氨氮等水質(zhì)指標(biāo)的變化

對10 mg/L的氨氮去除效果的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮含量的動態(tài)變化無明顯差異(P>0.05)，說明在海水生物絮凝系統(tǒng)構(gòu)建過程中，鹽度調(diào)節(jié)方式對氨氮的去除效果無明顯影響，3種鹽度調(diào)節(jié)方式均可用于海水生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。這與Kincannon等[23]的研究結(jié)果一致，經(jīng)過初期的滯后期后，微生物種群能夠適應(yīng)高鹽度環(huán)境，對絮凝的形成無持續(xù)抑制作用。

4 結(jié) 論

不同鹽度調(diào)節(jié)方式下海水生物絮團培養(yǎng)的啟動階段中，三態(tài)氮、絮團沉降性、微生物群落結(jié)構(gòu)和啟動完成后氨氮轉(zhuǎn)化的分析結(jié)果表明，在培養(yǎng)好的淡水生物絮凝系統(tǒng)中緩慢調(diào)節(jié)鹽度的淡水馴化調(diào)節(jié)鹽度方式，啟動培養(yǎng)周期最短；鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式，啟動培養(yǎng)周期較淡水馴化組長，但啟動完成后系統(tǒng)運行更穩(wěn)定；直接調(diào)節(jié)鹽度的方式運行周期最長。淡水馴化組微生物群落豐度較其他兩組高，但不同鹽度調(diào)節(jié)的海水生物絮凝啟動的系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著性差異，結(jié)合啟動完成后，3個處理組氨氮去除效果無顯著差異，故3種鹽度調(diào)節(jié)方式均可用于海水生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。綜上所述，鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式更有利于海水生物生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。