王成龍，陳 杰，蔣霞云，鄒曙明

( 上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)試驗(yàn)室，上海 201306 )

N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)是一種常用的化學(xué)誘變劑，它能對(duì)基因組DNA堿基產(chǎn)生烷基化修飾，使DNA在復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配，導(dǎo)致突變體生成[1-2]。ENU主要誘發(fā)不定點(diǎn)的單堿基突變，無(wú)任何傾向性，從而使基因發(fā)生突變，其誘變模式與自然變異相似[3-4]。同時(shí)，ENU誘變效率很高，約為其他誘變手段的10倍。在模式生物中，利用ENU獲得大規(guī)模突變體進(jìn)行功能基因的研究已成為常用手段。但在養(yǎng)殖魚類中的應(yīng)用報(bào)道很少。目前，僅前蘇聯(lián)采用ENU誘變結(jié)合雌核發(fā)育技術(shù)獲得了鯉魚優(yōu)良突變品系[5]。國(guó)內(nèi)方面，韓啟霞等[6]采用ENU浸泡的方法誘變銀鯽(Carassiusauratusgibelio)得到突變個(gè)體，鄒曙明等[7]用ENU誘變處理草魚(Ctenopharyngodonidellus)精子，產(chǎn)生了生長(zhǎng)速度顯著不同的F1代。

草魚肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因是一種肌細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)向調(diào)控因子，具有抑制肌肉分化和生長(zhǎng)的作用，其表達(dá)量與肌肉質(zhì)量的變化呈負(fù)相關(guān)[8-10]。目前，針對(duì)MSTN基因在哺乳動(dòng)物方面的功能及調(diào)控機(jī)理研究較多[11-15]，在水產(chǎn)動(dòng)物方面其研究還處于cDNA克隆與表達(dá)階段，功能研究相對(duì)較少[16-19]。魚類MSTN基因存在兩種亞型(MSTN1、MSTN2)并且時(shí)空表達(dá)具有較大的差異。濮劍威等[20]研究表明，MSTN1基因在草魚肌肉、腦和眼中的轉(zhuǎn)錄量較高，MSTN2基因只在腦和肌肉中有表達(dá)。并且通過(guò)注射MSTN1型mRNA過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致斑馬魚(Daniorerio)體節(jié)發(fā)生期胚胎的前后軸拉長(zhǎng)、背腹軸變短、脊索輕微扭曲及體節(jié)發(fā)育受到強(qiáng)烈抑制而不分化等現(xiàn)象。注射MSTN2型 mRNA胚胎早期發(fā)育有所延遲并未發(fā)生明顯變化，但發(fā)育至60 h之后尾部明顯發(fā)生嚴(yán)重彎曲。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP作為第三代分子遺傳標(biāo)記在分子育種方面已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[21-22]。MSTN基因的SNPs與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)研究在畜禽方面已有大量的報(bào)道[23-25]，在水產(chǎn)動(dòng)物方面，MSTN1基因在黃顙魚(Pelteobagrusefulvidraco)[26]、建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)[27]、吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)[28]、草魚[29]等可作為育種的候選分子標(biāo)記，而MSTN2基因SNPs與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)研究未見報(bào)道。筆者通過(guò)研究ENU誘變草魚4個(gè)家系的生長(zhǎng)，對(duì)比篩選出2個(gè)具有顯著生長(zhǎng)差異的家系，通過(guò)雙向測(cè)序在這2個(gè)家系中MSTN1、MSTN2基因找出SNP位點(diǎn)，為ENU誘變草魚生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供候選標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及管理

ENU誘變草魚親本來(lái)自于上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)育種中心。挑取6齡優(yōu)良ENU誘變草魚親本進(jìn)行人工繁殖，雌、雄草魚各4尾，每尾約25 kg。對(duì)親本進(jìn)行一雌一雄交配方式干法授精，建立4個(gè)ENU誘變草魚家系，將每個(gè)家系的受精卵分別放至孵化桶里進(jìn)行孵化，待受精卵孵化成平游的魚苗后，取每個(gè)家系魚苗約2000尾放入6 m×4 m×1.5 m的水泥池中暫養(yǎng)1個(gè)月后，再將每個(gè)家系魚苗平均分到2個(gè)水泥池中暫養(yǎng)65 d，從魚苗平游開始計(jì)算，第80 d通過(guò)剪鰭標(biāo)記法對(duì)家系1、家系2、家系3和家系4分別剪左胸鰭、不剪鰭、右胸鰭和左腹鰭加以區(qū)分，從每個(gè)家系中隨機(jī)挑選50尾稱量體質(zhì)量后同池混養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)組，約每隔30 d對(duì)每個(gè)家系補(bǔ)剪鰭后放回原水泥池，經(jīng)過(guò)175 d飼養(yǎng)，在每個(gè)水泥池各個(gè)家系中隨機(jī)挑選20尾進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量，測(cè)量完將4個(gè)家系草魚放到同一個(gè)土塘進(jìn)行飼養(yǎng)，放塘之前每個(gè)家系各取10尾魚鰭浸于95%酒精中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)量

用電子稱測(cè)量草魚體質(zhì)量(精確到0.01 g)；用直尺、圓規(guī)測(cè)量全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、體高、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、體厚形態(tài)性狀(精確至0.1 cm)。

1.3 基因組DNA提取及SNPs篩選

參照北京天根生物科技有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說(shuō)明書提取樣品基因組DNA?；蚪MDNA提取完成后，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和含量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的草魚MSTN1、MSTN2基因序列，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)MSTN1、MSTN2基因所需引物，基因所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用引物序列及長(zhǎng)度見表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA 60～100 ng，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL，Taq酶(2.5 U/μL)1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，0.1% DEPC處理過(guò)的去離子水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳條帶符合送測(cè)要求后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序的結(jié)果利用BioEdit軟件確定SNP位點(diǎn)(突變率高于30%)。

表1 ENU誘變草魚MSTN1、MSTN2基因部分區(qū)域擴(kuò)增SNP位點(diǎn)篩選所用的引物Tab.1 Primers used for screening SNP loci in partial regions of MSTN1 and MSTN2 genes in ENU mutagenized grass carp

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 19.0軟件[21]中一般線性模型對(duì)4個(gè)ENU誘變草魚家系的全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、體厚等性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。運(yùn)用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心、BioEdit對(duì)MSTN1、MSTN2基因中SNPs位點(diǎn)及氨基酸翻譯進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 ENU誘變草魚4個(gè)家系生長(zhǎng)性狀對(duì)比

第80 d，平均體質(zhì)量為家系1>家系4>家系3>家系2，絕對(duì)質(zhì)量增加率為家系1>家系4>家系3>家系2；第175 d，平均體質(zhì)量為家系4>家系1>家系2>家系3，絕對(duì)體質(zhì)量增加率為家系4>家系2>家系1=家系3(表2)。

4個(gè)ENU誘變草魚家系在第175 d各生長(zhǎng)性狀情況見表3，除家系1和家系2的體高和頭長(zhǎng)差異不顯著外，其他不同階段每?jī)蓚€(gè)家系間的各個(gè)性狀均差異顯著。

表2 4個(gè)ENU誘變草魚家系不同階段體質(zhì)量的增長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Growth statistics of body weight in four ENU mutagenized grass carp families with different stages

表3 4個(gè)ENU誘變草魚家系各生長(zhǎng)性狀特征值Tab.3 Characteristics of growth traits of four ENU mutagenized grass carp families

注：同一行數(shù)字后的字母不同表示差異顯著(P<0.05).

Note: means with different letters in the same line are significant differences(P<0.05).

對(duì)4個(gè)ENU誘變草魚家系在第175 d各形態(tài)性狀與體質(zhì)量的相關(guān)程度進(jìn)行了偏相關(guān)分析，結(jié)果見表4，各形態(tài)性狀與質(zhì)量顯著性相關(guān)由P<0.01判斷，因此各家系中與體質(zhì)量顯著性相關(guān)的性狀分別為：家系1中有全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、體厚，相關(guān)系數(shù)依次為0.357、0.619、0.608、0.396；家系2中有全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、體厚，相關(guān)系數(shù)依次為0.348、0.360、0.687、-0.384；家系3中有全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高，相關(guān)系數(shù)依次為0.529、0.449、-0.351、0.384；家系4中有全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體厚，相關(guān)系數(shù)依次為0.629、0.543、0.590。

對(duì)4個(gè)ENU誘變草魚家系在第175 d的全長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、體厚、體質(zhì)量與體長(zhǎng)的比例性狀進(jìn)行了因子分析。通過(guò)KMO和Bartlett檢驗(yàn)其度量值為0.705接近1，因此適合因子分析，其中第一主成分(P1)和第二主成分(P2)的貢獻(xiàn)率分別為39.11%、18.98%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為58.09%，表達(dá)式分別為：

P1=-0.113x1+0.376x2+0.436x3+0.228x4+0.006x5+0.335x6-0.033x7；

P2=0.368x1-0.014x2-0.372x3+0.065x4+0.400x5+0.053x6+0.408x7。

式中，x1為全長(zhǎng)/體長(zhǎng)、x2為體高/體長(zhǎng)、x3為頭長(zhǎng)/體長(zhǎng)、x4為尾柄長(zhǎng)/體長(zhǎng)、x5為尾柄高/體長(zhǎng)、x6為體厚/體長(zhǎng)、x7為體質(zhì)量/體長(zhǎng)。

各比例性狀的分布見圖1，7個(gè)比例性狀可分成兩組，第一主成分主要為體高/體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)/體長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)/體長(zhǎng)、體厚/體長(zhǎng)，第二主成分主要為全長(zhǎng)/體長(zhǎng)、尾柄高/體長(zhǎng)、體質(zhì)量/體長(zhǎng)。

每個(gè)家系個(gè)體根據(jù)第一主成分和第一主成分相關(guān)系數(shù)得分繪制散點(diǎn)圖(圖2)，家系4在第一主成分、第一主成分得分區(qū)域分布明顯與其他3個(gè)家系不同，家系2和家系3大部分個(gè)體分布重疊，家系1與家系2、家系3都有少部分個(gè)體質(zhì)量重疊。

注：P<0.01表示極其顯著.

Note:P<0.01 means very significantly different.

圖1 比例性狀因子主成分得分系數(shù)分布Fig.1 The coefficient distribution map of principal component score of proportional trait factor

圖2 4個(gè)ENU誘變草魚家系的各比例性狀特征主因子散點(diǎn)示意Fig.2 The scatter plot map of proportional trait factor in four ENU mutagenized grass carp families

2.2 MSTN1、MSTN2基因序列分析及SNPs位點(diǎn)篩選

本試驗(yàn)獲得草魚MSTN1基因全長(zhǎng)共3824 bp，包括2個(gè)內(nèi)含子(長(zhǎng)度分別為776、1008 bp)和3個(gè)外顯子(長(zhǎng)度分別為375、370、382 bp)，其GenBank為KP719016；對(duì)于MSTN2的mRNA全長(zhǎng)共1976 bp，其GenBank為KM874827.1。對(duì)MSTN基因進(jìn)行雙向測(cè)序，堿基在家系內(nèi)出現(xiàn)2次以上(包括2次)即確定為SNP突變位點(diǎn)。

對(duì)于MSTN1基因，家系3、4均在465位點(diǎn)C/G發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的氨基酸由脯氨酸變?yōu)榫彼?，家?還在467位點(diǎn)G/A均發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的氨基酸由天冬氨酸變?yōu)樘於０?圖3)。

對(duì)于MSTN2基因，家系3、4均在912位點(diǎn)C/T發(fā)生同義突變，編碼的氨基酸為絡(luò)氨酸，另外家系3在1027位點(diǎn)G/A產(chǎn)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，而家?在366位點(diǎn)A/G產(chǎn)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?圖4)。而位于非編碼區(qū)1390位點(diǎn)A/T和1401位點(diǎn)G/A發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)(圖4)。

3 討 論

3.1 生長(zhǎng)對(duì)比設(shè)計(jì)

在生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)中，試驗(yàn)對(duì)象初始規(guī)格的差異可以影響到整個(gè)試驗(yàn)結(jié)束的結(jié)果[30]，為減少前期生長(zhǎng)差異對(duì)后期試驗(yàn)的影響，親魚催產(chǎn)、人工授精、受精卵孵化、魚苗放到水泥池暫養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程均同步進(jìn)行，到了第80 d對(duì)每個(gè)ENU誘變草魚家系隨機(jī)挑取50尾進(jìn)行剪鰭標(biāo)記同池混養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)組，克服不同水泥池對(duì)生長(zhǎng)對(duì)比造成的影響。在整個(gè)飼養(yǎng)管理過(guò)程中，每日定時(shí)投喂2次，每次以水面留有少量飼料為準(zhǔn)，每次測(cè)量生長(zhǎng)性狀的操作是在室內(nèi)進(jìn)行，并且提前準(zhǔn)備足夠的冰水，盡量減少高溫對(duì)草魚的損傷。魚類標(biāo)記一般常用的方法有掛牌、剪鰭、染料標(biāo)記、熒光標(biāo)記、電子標(biāo)記等標(biāo)記技術(shù)，本試驗(yàn)使用的剪鰭標(biāo)記，相對(duì)于其他標(biāo)記有操作簡(jiǎn)單、保留時(shí)間持久、對(duì)魚傷害小等優(yōu)點(diǎn)，李思發(fā)等[31]研究了剪鰭標(biāo)記部位對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)的影響，指出剪左胸、右胸、左腹和右腹鰭標(biāo)記的魚之間以及剪不同標(biāo)記的魚與未剪鰭標(biāo)記的魚之間的生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

圖3 家系3和家系4 MSTN1基因部分序列SNP位點(diǎn)篩選Fig.3 SNP site selection of partial sequence of MSTN1 in family 3 and family 4

圖4 家系3和家系4 MSTN2基因部分序列SNP位點(diǎn)篩選Fig.4 SNP site selection of partial sequence of MSTN2 in family 3 and family 4

3.2 家系生長(zhǎng)差異分析

從平均體質(zhì)量和絕對(duì)質(zhì)量增加率來(lái)看，經(jīng)過(guò)175 d的養(yǎng)殖，家系4在這兩方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，而家系3生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)最弱，從4個(gè)家系各個(gè)生長(zhǎng)性狀對(duì)比可知，家系4明顯處于優(yōu)勢(shì)地位。從各個(gè)性狀與質(zhì)量的相關(guān)程度的角度分析，每個(gè)家系的主要相關(guān)性狀有所區(qū)別，家系1中相關(guān)系數(shù)最高的是尾柄長(zhǎng)(0.619)，其次是體長(zhǎng)(0.619)；家系2中相關(guān)系數(shù)最高的是頭長(zhǎng)(0.687)，明顯高于全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體厚；家系3中相關(guān)系數(shù)最高的是全長(zhǎng)(0.529)；家系4中全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體厚的相關(guān)系數(shù)相近。形態(tài)比例性狀在魚類分類中是一個(gè)很重要指標(biāo)，慶寧等[32]通過(guò)形態(tài)比例性狀對(duì)華南沿海地區(qū)西部不同水系的中間黃顙魚(P.intermedius)群體進(jìn)行了有效分類。本研究通過(guò)因子分析將多個(gè)相關(guān)的形態(tài)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為新的、個(gè)數(shù)較少且相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，通過(guò)4個(gè)家系個(gè)體在第一、二主成分因子得分系數(shù)圖可以有效區(qū)分家系4和家系3，由此可以看出家系4的生長(zhǎng)性狀相對(duì)于家系3具有明顯的生長(zhǎng)差異。

3.3 MSTN基因在ENU誘變草魚家系的SNP多態(tài)性

ENU溶液浸泡精子可在草魚中實(shí)現(xiàn)高效誘變，在誘變育種領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。前期研究顯示，ENU主要誘變草魚基因組DNA產(chǎn)生GC到AT，或者AT到GC的點(diǎn)突變，可造成密碼子的無(wú)義突變、錯(cuò)義突變和同義突變，ENU對(duì)上述草魚基因組的平均誘變率為0.41%[7]。本試驗(yàn)選取的4個(gè)ENU誘變草魚家系均是具有顯著生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的個(gè)體。通過(guò)對(duì)MSTN1、MSTN2基因初篩選出不同的SNP位點(diǎn)，對(duì)于MSTN1基因，家系3和家系4均在465位點(diǎn)C/G發(fā)生錯(cuò)義突變，家系3還在467位點(diǎn)G/A發(fā)生錯(cuò)義突變。對(duì)于MSTN2基因，家系3、4均在912位點(diǎn)C/T發(fā)生同義突變，家系3在1027位點(diǎn)G/A產(chǎn)生錯(cuò)義突變，而家系4在366位點(diǎn)A/G產(chǎn)生錯(cuò)義突變。由此推測(cè)，家系3和家系4產(chǎn)生的顯著生長(zhǎng)差異，與MSTN基因的SNP位點(diǎn)差異導(dǎo)致編碼的氨基酸不同，使該基因功能表達(dá)差異有聯(lián)系，因此家系3和家系4可作為試驗(yàn)材料來(lái)研究MSTN基因相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)，為后續(xù)的ENU誘變草魚的分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。