王竹承 劉輝 李榮華

（1. 滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，滄州 061001；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴陽(yáng) 550006）

鎘（Cadmium，Cd）是一種能對(duì)人體造成巨大威脅的重金屬污染物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤的Cd污染位點(diǎn)超標(biāo)率已達(dá)7%，Cd已成為我國(guó)土壤重金屬污染中的首要污染物［1］。Cd脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量上升，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)、抑制碳固定酶活性，并通過(guò)影響蛋白酶活性而導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂等［2-3］。另外，Cd脅迫抑制營(yíng)養(yǎng)元素吸收而導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受限［4］。同時(shí)還能通過(guò)食物鏈危害人體健康［5］。因此，研究緩解或解除植物中Cd毒害的措施及其機(jī)理，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

硫（Sulfur，S）是植物體內(nèi)胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等的組成成分，而這些含硫氨基酸參與幾乎所有蛋白質(zhì)的合成，包括光合膜蛋白，因而對(duì)植物光合作用起著重要作用［6］。研究表明，半胱氨酸可通過(guò)其自身的抗氧化特性調(diào)節(jié)大麥氧化還原水平以緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制［7］。充分的硫肥可保證充足的還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）供應(yīng)，以緩解因鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化脅迫對(duì)植物光合效率和生長(zhǎng)的影響［8］。同時(shí)，植物對(duì)S的吸收和同化可促進(jìn)蛋白源和非蛋白源硫醇的合成，以及鐵膠膜（Iron plaque）的形成，從而提升植物對(duì)Cd的耐受性［9］。研究表明，添加外源S可以提升Cd脅迫下植物體內(nèi)GSH的合成，降低ROS的積累，減少ROS對(duì)植物葉片基質(zhì)蛋白和類(lèi)囊體蛋白的攻擊，調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)，從而增強(qiáng)植物的光合能力［6］；提升植物螯合素（Phytochelatins，PCs）、金屬耐受蛋白（Metallothioneins，MTs）的合成，并與Cd結(jié)合形成螯合物，降低Cd毒性［10-11］。因此，適量添加S肥對(duì)作物正常生長(zhǎng)和緩解Cd毒過(guò)程具有重要意義。然而，當(dāng)前對(duì)外源S是否影響與植物光合作用緊密相關(guān)的礦質(zhì)元素的吸收，并揭示其與光合作用之間關(guān)聯(lián)性的研究相對(duì)缺乏。

馬齒莧（Portulaca oleraceaL.）是中國(guó)古老的菜藥兼用性肉質(zhì)草本植物［12］。鑒于馬齒莧的高營(yíng)養(yǎng)保健功效，已經(jīng)馴化出栽培型馬齒莧品種，品質(zhì)和口感均較野生型品種有所提高。但是，農(nóng)業(yè)土壤Cd污染的加重，加之馬齒莧對(duì)Cd具有較高的吸附效應(yīng)，導(dǎo)致馬齒莧的食用安全性大大降低［13］。因此，需要通過(guò)適當(dāng)?shù)拇胧?，減少Cd向馬齒莧葉片中的轉(zhuǎn)移，提升其可食用性。當(dāng)前對(duì)馬齒莧對(duì)Cd脅迫生理生化響應(yīng)機(jī)制的研究較少，更缺乏外源添加物影響馬齒莧重金屬耐受性的相關(guān)研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)外源S可以通過(guò)增強(qiáng)馬齒莧體內(nèi)乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)GSH的合成，而降低葡萄糖含量，從而緩解Cd脅迫誘導(dǎo)的氧化脅迫和葡萄糖介導(dǎo)的光合抑制作用，并降低馬齒莧對(duì)Cd的吸收。然而，關(guān)于外源S促進(jìn)Cd脅迫下馬齒莧光合作用的內(nèi)在機(jī)制仍未可知。

本研究以馬齒莧為試材，探討Cd脅迫下外源S對(duì)馬齒莧葉片光合作用、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的影響，以揭示在添加外源S的情況下，馬齒莧礦質(zhì)元素與光反應(yīng)系統(tǒng)之間的關(guān)聯(lián)性，為揭示外源S緩解重金屬毒害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬齒莧種子購(gòu)自江蘇長(zhǎng)景種業(yè)有限公司（荷蘭進(jìn)口）。將馬齒莧種子于35℃水浴浸種處理12 h，播于裝有沙子的育苗盒（15穴，穴上口3.0 cm ×3.0 cm，穴底徑3.0 cm×3.0 cm，穴深4 cm）中，置于人工氣候培養(yǎng)箱（LRH-800-GS，天津市福元銘儀器設(shè)備有限公司）中栽種。培養(yǎng)箱條件：14 h白天/10 h黑夜，晝夜溫度為30℃/25℃，相對(duì)濕度75%，光強(qiáng)設(shè)置為 500 μmol/（m2·s）。前期每天用自來(lái)水澆水一次，生長(zhǎng)一周后改用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)液（pH6.0）澆水，澆水量以使沙子充分濕潤(rùn)為準(zhǔn)。待馬齒莧幼苗長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好和長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)處理。

前期試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧最適Cd處理濃度和S處理濃度分別為100和400 mg/L。本研究設(shè)置3個(gè)處理：1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（CK）、1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mg/L CdCl2（T1）和1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 +100 mg/L CdCl2+400 mg/L（NH4）2SO4培養(yǎng)液（T2）。為排除NH4

+的影響，在CK和T1組均添加相同濃度的NH4Cl。每個(gè)處理8盆，每盆種植15株。脅迫處理15 d后進(jìn)行指標(biāo)參數(shù)測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定生物學(xué)重復(fù)3次，取平均值。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量的測(cè)定 稱(chēng)取植株中上部功能葉片0.5 g于4℃預(yù)冷的研缽中，加入5 mL 80%的預(yù)冷丙酮和少許MgCO3，于冰上避光條件下研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，殘?jiān)? mL 80%的丙酮洗入離心管中。4 000 r/min 4℃離心后，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中。按上述方法對(duì)殘?jiān)恋碛?0%丙酮進(jìn)行重懸浮、離心，直至沉淀呈白色為止。定容后，采用722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海添時(shí)科學(xué)儀器有限公司）分別測(cè)定645和663 nm波長(zhǎng)下葉綠素提取液的吸光值，采用以下公式計(jì)算葉綠素含量［14］：

1.2.2 光合參數(shù)測(cè)定 利用LI-6400XT便攜式光合測(cè)定儀（LI-COR公司，美國(guó)）測(cè)定不同處理下馬齒莧葉片的光合速率（Net photosynthesis rate，Pn）、蒸騰速率（Transpiration rate，Tr）、氣孔導(dǎo)度（Stomatal conductance，Gs）、胞間二氧化碳濃度（Intercellular CO2concentration，Ci），使用人工光源，光強(qiáng)為1 000 μmol/（m2·s）。

1.2.3 葉片熒光參數(shù)的測(cè)定 用配有熒光葉室的 LI-6400XT便攜式光合系統(tǒng)（LI-COR公司，美國(guó)）測(cè)定成熟葉片的凈光合和熒光-光強(qiáng)響應(yīng)曲線及暗呼吸速率（Dark respiration rate，R）。設(shè)定如下參數(shù)：氣孔比率為0，參比室CO2濃度為400 μmol/mol，氣體流速300 μmol/s，干燥管全旁路，氣溫30℃。參照萬(wàn)雪琴等［15］方法測(cè)定各處理?xiàng)l件下馬齒莧葉片的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、恒態(tài)熒光（Fs）、能化類(lèi)囊體最大熒光（F'm）、能化類(lèi)囊體最小熒光（F'o）和氣體交換參數(shù)。具體操作如下：（1）將葉片放于葉室中，暗適應(yīng)30 min后，記錄暗呼吸速率。然后在開(kāi)啟熒光記錄（Fluorescence recording）的同時(shí)，于中心波長(zhǎng)為630 nm處，測(cè)定Fo值。然后用中心波長(zhǎng)為630 nm，光強(qiáng)為8 000 μmol/（m2·s）的飽和光測(cè)定Fm；（2）用強(qiáng)調(diào)為 1 000 μmol/（m2·s）的測(cè)定光持續(xù)照光20 min，測(cè)得Fs，然后用8 000 μmol/（m2·s）的飽和光（同上）測(cè)得F'm，最后在暗脈沖（即中心波長(zhǎng)為740 nm的遠(yuǎn)紅光，同時(shí)關(guān)閉LED光化學(xué)光）的作用下測(cè)得F'o。

用光強(qiáng) ＜100 μmol/（m2·s）范圍內(nèi)的光響應(yīng)回歸直線方程求算光補(bǔ)償點(diǎn)（Light compensation point，LCP）、光飽和點(diǎn)（Light saturation point，LSP）、表觀量子效率（Apparent quantum efficiency，AQE）；用通過(guò)擬合各處理的光響應(yīng)曲線求得的回歸方程，計(jì)算出凈光合速率達(dá)到最大光合速率90%處的光強(qiáng)作為光飽和點(diǎn)。其他光合參數(shù)計(jì)算如下：

其中，PFD表示光強(qiáng)，α是葉片對(duì)入射光的吸收比率常數(shù)，取值0.85。

1.2.4 Cd含量與礦質(zhì)元素含量測(cè)定 收集脅迫處理后的馬齒莧葉片，稱(chēng)取鮮重，110℃殺青1 h、70℃恒溫干燥、稱(chēng)重。干樣用HNO3-HClO4（4∶1 V/V）消煮（160℃）至澄清，定容以后，利用AA370MC型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定各組織中的Ca、Mg、Fe、Cu和Mn等礦質(zhì)元素含量［16］。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示。采用SPSS18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各處理間數(shù)據(jù)采用方差分析（One way ANOVA），利用最小顯著差（Least significant difference，LSD）法檢驗(yàn)差異顯著性（P≤0.05），采用excel 2007作圖。

2 結(jié)果

2.1 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片葉綠素含量的影響

由表1可知，與對(duì)照相比，100 mg/L Cd處理使馬齒莧葉片中的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量分別降低47.01%、41.30%和38.19%，葉綠素a/b比值則顯著降低22.90%。而添加外源S以后，與Cd處理（T1）相比，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量顯著上升，葉綠素a/b比值顯著增加，其中，葉綠素a含量幾乎恢復(fù)至對(duì)照水平（表1）。

表1 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片葉綠素含量的影響

2.2 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片光合參數(shù)的影響

由圖1看出，與對(duì)照相比，Cd處理15 d后，馬齒莧葉片的Pn、Tr和Gs分別降低196.18%、165.65%和74.57%，而Ci則顯著提升70.96%。與Cd 處理（T1）相比，外施 400 mg/L（NH4）2SO4處理（T2）導(dǎo)致馬齒莧葉片的Pn、Tr和Gs分別提升96.45%、79.94%和27.53%，Ci值則顯著降低30.92%。表明外源S可以緩解Cd脅迫對(duì)馬齒莧葉片光合作用的影響。

馬齒莧葉片的最大凈光合速率（Pnmax）、光飽和點(diǎn)（LSP）、表觀量子效率（AQE）和呼吸速率（R）在Cd處理以后，與對(duì)照相比，分別降低182.31%、134.07%、205.56%、107.14%，光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）則上升150.96%（表2）。與Cd處理（T1）相比，添加外源S可使Pnmax、LSP、AQE和R分別提升93.86%、96.06%、155.56%和59.52%，而LCP則降低47.38%。結(jié)果表明，外源S可顯著促進(jìn)Cd脅迫下馬齒莧葉片的碳同化能力和新陳代謝速率。

圖1 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片凈光合速率Pn、蒸騰速率Tr、氣孔導(dǎo)度Gs和胞間CO2濃度Ci的影響

2.3 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

與對(duì)照（CK）相比，Cd處理（T1）可使馬齒莧在暗適應(yīng)下的葉綠素最小熒光（Fo）顯著提升49.49%，而光適應(yīng)下的kP/kN、最大熒光（Fm）、PSⅡ最大量子效率（Fv/Fm）、實(shí)際量子效率（ΦPSII）和電子傳遞速率（J）分別降低55.43%、42.36%、31.11%、45.83%和64.05%（表3）。另外，Cd處理導(dǎo)致非化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）顯著提升45.28%，而化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）則下降51.06%（表3）。在添加外源S以后，與Cd處理（T1）相比，F(xiàn)o和qN分別降低19.49%和16.88%，而kP/kN、Fm、Fv/Fm、ΦPSⅡ和J則分別提升53.73%、58.97%、35.01%、56.52%、38.46%和107.75%（表3）。

2.4 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片中與光合系統(tǒng)相關(guān)礦質(zhì)元素含量的影響

與CK相比，Cd處理（T1）可使馬齒莧葉片Ca、Fe含量分別提升25.52%和40.02%，而Mg、Mn、Cu含量則分別降低194.28%、96.88%和217.96%（表4）。與Cd處理（T1）相比，外施400mg/L（NH4）2SO4（T2）可使 Ca、Fe含量顯著提升23.13%和35.27%，同時(shí)可使Mg、Mn、Cu含量分別提升99.44%、40.49%和111.76%（表4）。結(jié)果表明，外源S可以顯著提升馬齒莧對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，從而增強(qiáng)其在Cd脅迫環(huán)境中的光合作用。

表2 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片光合作用的影響

表3 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片葉片PSII光化學(xué)效率參數(shù)的影響

表4 外源S對(duì)Cd脅迫下馬齒莧葉片礦質(zhì)元素含量的影響

3 討論

植物受到重金屬脅迫時(shí)，典型癥狀就是抑制葉綠素的合成，導(dǎo)致葉色黃化，從而顯著抑制植物的光合作用。因此，葉綠素含量常作為判斷植物抗逆性能的重要指標(biāo)［17］。本研究表明，Cd脅迫可顯著降低馬齒莧葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量，同時(shí)降低葉綠素a/b比值，而外源S則可使葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量以及葉綠素a/b比值上升，表明外源S可通過(guò)增強(qiáng)馬齒莧葉綠素的合成增強(qiáng)馬齒莧的抗Cd性。這與外源S可促進(jìn)Cd脅迫下小白菜葉綠素合成的研究結(jié)果一致［18］。

通常情況下，逆境脅迫引起植物光合速率下降的主要原因可歸為兩類(lèi)：一是受氣孔導(dǎo)度（Gs）影響的氣孔因素；二是受葉肉細(xì)胞光合活性影響的非氣孔因素［19-20］。Farquhar等［21］認(rèn)為當(dāng)Pn、Gs和Ci值在逆境中同時(shí)降低，則表明氣孔因素是抑制Pn的主要原因；若植物葉片Pn值下降，而Ci值卻上升，則表明光合作用的抑制是由非氣孔因素引起的。本研究顯示，Cd處理15 d后，馬齒莧葉片的Pn、Gs值顯著下降，而Ci值顯著上升，表明非氣孔因素是Cd脅迫誘導(dǎo)馬齒莧葉片光合效率下降的主要因素。外施S能顯著提升Cd脅迫下馬齒莧葉片Pn、Tr和Gs值，從而提升了馬齒莧葉肉細(xì)胞光合活性，提升光合速率。Khan等［22］和Masood等［23］均發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下印度芥菜葉片Pn、Gs和Ci值均顯著降低；外源S可顯著提升Cd脅迫下印度芥菜葉片Pn、Tr和Gs值，促進(jìn)光合作用，表明氣孔因素是Cd誘導(dǎo)印度芥菜光合抑制的主要原因，同時(shí)也說(shuō)明不同植物響應(yīng)Cd脅迫時(shí)所采用的機(jī)制不同。

葉綠體的主要作用是將吸收的光能通過(guò)光合電子傳遞、葉綠素?zé)晒夂蜔岷纳?種途徑進(jìn)行消化，因而逆境脅迫中植物葉片熒光參數(shù)的變化可以反映光合作用的情況［24-25］。Fv/Fm和Fo的變化可作為鑒別植物抗逆性的重要指標(biāo)，而qP和qN則分別表示PSII天線色素吸收的光能用于光合電子傳遞的光能和以熱能形式消耗的光能［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd處理可使馬齒莧葉片F(xiàn)o和qN顯著增加，而kP/kN、Fm、Fv/Fm、ΦPSII、電子傳遞速率（J）和qP顯著下降（表 3）。添加外源S則可顯著降低Fo和qN值，而kP/kN、Fm、Fv/Fm、ΦPSII、J和qP則顯著上升（表3）。Fm隨被激發(fā)的葉綠素分子數(shù)量的增加而上升，因而Cd處理下馬齒莧葉片F(xiàn)m的降低與葉綠素分子減少有關(guān)［15］，這與本研究中葉綠素a和葉綠素b含量降低的結(jié)果一致。Cd處理下Fo的上升和kP/kN的下降表明被葉綠素吸收的能量轉(zhuǎn)化成電能（電子傳遞）的比例下降，這與單位面積葉綠素分子數(shù)量減少，使光能在天線色素分子間的傳遞效率顯著降低有關(guān)，同時(shí)與PSII反應(yīng)中心數(shù)量減少或遭破壞而導(dǎo)致捕獲天線色素分子傳來(lái)的能量效率降低緊密相關(guān)［15］。Cd脅迫下馬齒莧葉片qN的上升和qP的降低，表明天線色素分子所捕獲的光能主要以熱量而散失掉，從而導(dǎo)致ΦPSII和J的顯著降低，導(dǎo)致PSII反應(yīng)中心的電子供體側(cè)的電子傳遞障礙。而添加外源S，則可提升qP值而降低qN值，增強(qiáng)天線色素分子對(duì)光能的捕獲和傳遞效率，從而促進(jìn)馬齒莧葉片PSII光反應(yīng)系統(tǒng)。

前人對(duì)Cd處理導(dǎo)致植物葉片黃化的原因總結(jié)為3類(lèi)：一是認(rèn)為Cd脅迫降低植物對(duì)Fe、Mg等礦質(zhì)元素的吸收，直接抑制葉綠素的合成而失綠［27］；二是認(rèn)為Cd脅迫抑制植物對(duì)Mn的吸收而間接抑制葉綠素的生物合成［28］；三是Cd脅迫破壞葉綠體結(jié)構(gòu)破壞和合成受阻，間接導(dǎo)致失綠癥［29］。本研究發(fā)現(xiàn)Cd處理后馬齒莧葉片中Ca和Fe含量顯著上升，而Mg、Mn、Cu含量顯著降低，添加外源S則可使5種礦質(zhì)元素含量均顯著上升，表明Cd處理導(dǎo)致的馬齒莧葉片失綠不是Fe、Ca虧缺引發(fā)的，而與Mg、Mn和Cu的缺乏有關(guān)。Mg是葉綠素分子的直接組成成分，參與誘導(dǎo)類(lèi)囊體光合膜垛疊成基粒，對(duì)提高PSII的相對(duì)熒光產(chǎn)量、活性、原初光能轉(zhuǎn)化效率和葉綠體電子傳遞速率具有重要作用［30］；Mn是許多碳固定相關(guān)酶（如檸檬酸脫氫酶、草酰琥珀酸脫氫酶）的活化劑，Mn聚集體和3條多肽鏈構(gòu)成的復(fù)合體帽結(jié)構(gòu)是PSII氧化端最主要的結(jié)構(gòu)單元-放氧復(fù)合體（OEC）的重要組成部分，Mn聚集體的破壞可抑制水的光解和電子傳遞［15，31-32］；Cu是是光合作用電子傳遞鏈中質(zhì)藍(lán)素（Plastocyanin）的組成成分，銅的虧缺可導(dǎo)致光合電子傳遞活力下降［32］。因此，Cd處理后Mg、Mn、Cu含量的降低是導(dǎo)致馬齒莧葉片黃色癥狀、光合效能和光合電子傳遞下降的主要原因。Matraszek等［33-35］研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫誘導(dǎo)的小麥、白芥菜、萵筍葉片N、P、K、Ca、Mg等離子的降低，抑制植物生長(zhǎng)，而外施S則可促進(jìn)這些植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。本試驗(yàn)表明外源S顯著促進(jìn)馬齒莧對(duì)Ca、Fe、Mg、Mn、Cu的吸收，推斷外源S提高葉綠素含量的原因可能是通過(guò)提高對(duì)Fe、Mg、Mn、Cu等的吸收和運(yùn)輸，促進(jìn)其向葉綠體的分配，從而增強(qiáng)馬齒莧葉片葉綠素的合成和葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性，維持馬齒莧穩(wěn)定的光合速率和PSII光反應(yīng)系統(tǒng)功能，以抵御Cd脅迫環(huán)境。

4 結(jié)論

從光合作用層面，外源S誘導(dǎo)馬齒莧Cd脅迫耐性的可能機(jī)理為：（1）增強(qiáng)馬齒莧葉片葉綠素a、葉綠素b的合成；（2）提升Cd脅迫下馬齒莧葉片Pn、Tr和Gs值，通過(guò)抑制非氣孔因素引起的馬齒莧葉肉細(xì)胞光合活性降低，提升光合速率；（3）提升qP值而降低qN值，提升天線色素分子對(duì)光能的捕獲和傳遞效率，增強(qiáng)馬齒莧葉片PSⅡ光反應(yīng)系統(tǒng)；（4）促進(jìn)馬齒莧對(duì)Ca、Fe、Mg、Mn、Cu的吸收，促進(jìn)葉綠素的合成、葉綠體和放氧復(fù)合體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和質(zhì)藍(lán)素的合成，提高PSII的相對(duì)熒光產(chǎn)量、活性和原初光能轉(zhuǎn)化效率，以及水的光解和PSⅡ電子傳遞速率，從而增強(qiáng)光合作用。