易雪麗， 袁朝原， 陳曉穎， 鄧 鷹， 譚 曇， 滕元姬， 羅 斌

豬鏈球菌病為人畜共患病，可通過豬傳人途徑傳播。豬鏈球菌根據(jù)其莢膜多糖抗原分為35個(gè)血清型，其中2型致病性最強(qiáng)，是人感染豬鏈球菌病的最主要病原[1]。人感染豬鏈球菌一般以散發(fā)病例多見，在我國多個(gè)省市均有散發(fā)病例報(bào)道[2-3]，但也曾有過罕見的大流行；1998年在江蘇江陰、2005年在四川資陽分別出現(xiàn)了2次2型豬鏈球菌病大流行，且表現(xiàn)出了罕見的“鏈球菌中毒性休克綜合征”，發(fā)病急驟，來勢(shì)兇險(xiǎn)，病死率高[4]。2016年在廣西也有人感染豬鏈球菌疫情報(bào)道，共引起6例發(fā)病，1例死亡[5]。

豬鏈球菌的致病力主要取決于其毒力因子，對(duì)豬鏈球菌毒力因子的研究主要集中于單個(gè)毒力因子的致病性方面，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種豬鏈球菌毒力因子，包括莢膜多糖（cps2J）、溶菌酶釋放相關(guān)蛋白（mrp）、細(xì)胞外蛋白因子（ef）、纖粘連蛋白結(jié)合蛋白（fbps）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gapdh）和毒力相關(guān)基因orf2等[6-8]。其中cps2J為主要毒力基因，同時(shí)也是豬鏈球菌2型的型特異性基因，可以作為鑒定豬鏈球菌2型的靶基因。目前上海、廣東和四川等地都有致病性豬鏈球菌毒力因子檢測(cè)相關(guān)報(bào)道[9-11]，百色地區(qū)尚未有相關(guān)報(bào)道。為了解本地區(qū)豬鏈球菌對(duì)常用抗生素的耐藥及其分子流行病學(xué)特征，本課題收集了右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2015－2019年臨床分離的豬鏈球菌，檢測(cè)其對(duì)常用抗生素敏感性及其毒力基因攜帶情況，為本地區(qū)人感染豬鏈球菌病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源 收集我院2015－2019年從豬鏈球菌腦膜炎患者標(biāo)本中分離的豬鏈球菌19株。其中分離自血液4株，分離自腦脊液15株。所有菌株分離培養(yǎng)按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版進(jìn)行[12]，分離菌株于-80 ℃冰箱中保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 VITEK MS V3.0（法國生物梅里埃公司）；PCR儀（美國BioRad公司）；電泳及凝膠成像設(shè)備（美國BioRad公司）；哥倫比亞血瓊脂平皿購自鄭州安圖生物公司；純乙腈購自法國生物梅里埃公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）由法國生物梅里埃公司提供；DL-96 STREP購自珠海迪爾生物工程有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR SuperMix購自Invitrogen公司；DNA Marker DL 2000購自寶生物工程（大連）有限公 司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定 使用VITEK MS V3.0實(shí)施基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。將菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平皿，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。用一次性接種環(huán)挑取適量細(xì)菌均勻涂布于VITEK MS靶板上，隨后加1 μL基質(zhì)溶液于樣品上，自然晾干。同時(shí)以ATCC 8739作為質(zhì)控菌株，采用VITEK MS IVD模式進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)采集和鑒定分析。

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn) 按照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定豬鏈球菌對(duì)8種常用抗生素的敏感性，包括青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、萬古霉素、紅霉素、克林霉素，結(jié)果判讀參照CLSI M100 2019年版中草綠色鏈球菌判斷標(biāo) 準(zhǔn)。

1.2.3 毒力基因檢測(cè) 按照說明書使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取豬鏈球菌基因組DNA作為模板，參照文獻(xiàn) [13]合成特異性引物對(duì)豬鏈球菌的16S rDNA、cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh進(jìn)行擴(kuò)增，引物相關(guān)序列及退火溫度見表1。采用50 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min。取7號(hào)標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州艾基生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST比對(duì)分析，確定為目的基因后作為陽性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像后與陽性對(duì)照進(jìn)行比對(duì)，所出現(xiàn)條帶與陽性對(duì)照大小相同者為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定

19株菌株經(jīng)VITEK MS鑒定均為豬鏈球菌，鑒定正確率99%以上。

2.2 藥物敏感性試驗(yàn)

19株豬鏈球菌對(duì)氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松和萬古霉素100%敏感，對(duì)青霉素的敏感率為68.5%，對(duì)紅霉素、克林霉素100%耐藥。藥敏結(jié)果見表2。

2.3 毒力基因檢測(cè)

利用合成的特異性引物對(duì)提取的豬鏈球菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，7號(hào)標(biāo)本在預(yù)期位置均出現(xiàn)條帶，見圖1。送擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示與GenBank中登記的目的基因100%同源，以7號(hào)標(biāo)本作為陽性對(duì)照。根據(jù)豬鏈球菌16S rDNA種特異性基因和6種常見毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，19株均為豬鏈球菌，cps2J型特異性基因檢測(cè)結(jié)果顯示19株菌株中有16株均為豬鏈球菌2型。19株中有12株攜帶6個(gè)常見毒力基因，4株攜帶5個(gè)常見毒力基因，2株攜帶4個(gè)常見毒力基因，1株攜帶3個(gè)常見毒力基因。所有菌株均攜帶了ef與fbps這2個(gè)毒力基因。各樣本毒力基因擴(kuò)增結(jié)果見表3。

表1 豬鏈球菌基因檢測(cè)引物及其產(chǎn)物大小Table 1 Primers used to detect genes in Streptococcus suis and expected product sizes

表2 19 株豬鏈球菌對(duì)常用抗生素的藥敏結(jié)果Table 2 Susceptibility of 19 strains of Streptococcus suis to common antibiotics（%）

圖1 毒力基因檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Electrophoretic analysis of virulence genes in 1% agarose gel after PCR amplification

表3 豬鏈球菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of virulence gene detection in Streptococcus suis

3 討論

人感染豬鏈球菌主要是接觸了感染豬鏈球菌的病豬、死豬，病原菌經(jīng)破損的皮膚和黏膜進(jìn)入體內(nèi)致使人感染豬鏈球菌，從事生豬屠宰的人員為豬鏈球菌病高發(fā)人群。豬鏈球菌感染人后以引起腦膜炎為主，患者大多有不同程度發(fā)熱，部分病例有意識(shí)障礙、腦膜刺激癥及休克等表現(xiàn)。該病起病急，病程兇險(xiǎn)，病死率高且預(yù)后不良，部分病例有不同程度的聽力損害。根據(jù)臨床癥狀不同，將人感染豬鏈球菌分為普通型、腦膜炎型、休克型和混合型。桑福德抗微生物治療指南對(duì)于豬鏈球菌感染推薦治療方案為首選青霉素，次選萬古霉素或頭孢曲松；休克型患者常選用青霉素類和氨基糖苷類或喹諾酮類聯(lián)合抗感染以及人工呼吸機(jī)支持呼吸、中心靜脈壓監(jiān)測(cè)、積極擴(kuò)容等；腦膜炎型患者更需在抗感染的同時(shí)積極降顱壓，給予激素以減輕粘連等治療[2]。

本課題采用了MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)19株分離株進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果顯示該技術(shù)可以準(zhǔn)確地鑒定出豬鏈球菌[14]。MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)微生物鑒定的理論基礎(chǔ)是將設(shè)備采集的未知樣品蛋白指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知菌種的圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)聚類分析，獲得鑒定結(jié)果[14]。該技術(shù)在細(xì)菌和酵母的鑒定方面已經(jīng)很成熟，同時(shí)因?yàn)樵摷夹g(shù)快速準(zhǔn)確，操作簡便且成本低，所以近年來在全國得到快速普及。隨著MALDI-TOF MS臨床應(yīng)用的普及，大大縮短了臨床病原微生物的鑒定報(bào)告時(shí)間，為臨床治療爭取了寶貴時(shí)間。19株豬鏈球菌的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，所有分離株對(duì)氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟和萬古霉素敏感率為100%，但是對(duì)青霉素的敏感率有所降低，特別應(yīng)注意的是對(duì)紅霉素和克林霉素100%耐藥。畜牧業(yè)一直極為關(guān)注豬鏈球菌對(duì)常用抗生素的耐藥性。蔡田等[15]研究結(jié)果顯示，豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率高達(dá)98.1%，大部分?jǐn)y帶ermB耐藥基因。胡軍勇等[16]研究結(jié)果同樣顯示豬鏈球菌對(duì)林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基呋喃類藥物的耐藥率均在90%以上。本研究結(jié)果與之相符，豬鏈球菌病為人畜共患病，人源分離豬鏈球菌對(duì)紅霉素及克林霉素的高耐藥性考慮源自于病豬。豬鏈球菌的致病力主要取決于其所攜帶的毒力因子，有研究結(jié)果顯示，攜帶mrp和ef是豬鏈球菌高致病性的標(biāo)志，本次毒力基因檢測(cè)顯示mrp攜帶率為84.2%，ef攜帶率為100%，這一結(jié)果與我國其他地區(qū)的報(bào)道相一致[11，17]。此外，fbps攜帶率為100%，要遠(yuǎn)高于李小軍[9]的報(bào)道。因此，本地區(qū)流行的豬鏈球菌主要以cps2J、mrp、ef、orf2、fbps、gapdh型為主。

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，豬鏈球菌病的發(fā)生趨勢(shì)也呈明顯上升。因此及時(shí)掌握本地區(qū)致病性豬鏈球菌對(duì)常用抗生素的耐藥性及其毒力因子的流行病學(xué)，對(duì)于預(yù)防和控制大規(guī)模暴發(fā)豬鏈球菌病具有重要的意義。