董倩倩，張俊萍

(1.周口市中心醫(yī)院肛腸外科，河南 周口 466000； 2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450004)

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌是第三大惡性腫瘤，并且在腫瘤相關(guān)性死亡率中居第四位。預計在2030年，結(jié)直腸癌的發(fā)生率將會增長60%[1]。目前，遺傳學與轉(zhuǎn)錄組學的相關(guān)研究進展極大地促進了結(jié)直腸癌的診斷與治療，但是晚期結(jié)腸癌對大多數(shù)聯(lián)合治療措施往往會形成腫瘤耐藥，最終轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌相關(guān)性死亡的主要原因[2]，因此，防止結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移，并且有效延長結(jié)腸癌患者的生存期就顯得尤為關(guān)鍵。近來，由于基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)具有顯著的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，越來越多的科研工作者開始關(guān)注和探索其抗腫瘤機制，并且以此開發(fā)相應的抗腫瘤藥物[3]。中國傳統(tǒng)中藥蟾酥(Bufonis Venenum)為中華大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)的耳后腺體分泌的白色漿液，經(jīng)干燥加工制得[4]。目前認為，蟾毒靈是蟾酥抗腫瘤作用的主要活性單體，對多種實體瘤包括胃癌、肝癌、食管癌、肺癌，以及白血病等具有治療作用[5-9]。蟾毒靈是否能夠通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)的相互作用關(guān)系從而抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，國內(nèi)外鮮見報道。本實驗旨在研究蟾毒靈通過調(diào)控MMP-2 和TIMP-2抑制人結(jié)腸癌細胞HCT116侵襲和遷移的作用機制，為蟾毒靈抗消化道腫瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人結(jié)腸癌細胞HCT116

HCT116購自中國科學院上海細胞庫，用含有體積分數(shù)100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分數(shù)為50 mL/L的CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，當細胞匯合度達到80%時消化細胞進行傳代及后續(xù)實驗。

1.2 藥品、試劑與儀器

蟾毒靈標準品購自北京索萊寶科技有限公司，批號7023021，使用前用1 mmol/L二甲基亞砜(DMSO)溶解，得到50 mmol/L的母液，實驗給藥時用含20 mL/L 血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。順鉑(DDP)注射液，江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司產(chǎn)品，批號080602；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基，美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號SH30809.1；胎牛血清，美國Gibco 公司產(chǎn)品，批號10099-141；胰蛋白酶，中國碧云天公司產(chǎn)品，批號041819190617；人工重構(gòu)基底膜膠，美國Corning公司產(chǎn)品，批號8204010；Transwell小室，美國Corning公司產(chǎn)品，批號302140003；CCK-8檢測試劑，美國Vazyme公司產(chǎn)品，批號A311-02-AA；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，中國碧云天公司產(chǎn)品，批號P0009-1；SYBR PremixEx TaqTMⅡ，美國Takara公司產(chǎn)品，批號AIF2352A；MMP-2，美國Cell Signaling Techology公司產(chǎn)品，批號40994S；TIMP-2，美國Cell Signaling Techology公司產(chǎn)品，批號5738S；β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體，美國Cell Signaling Techology公司產(chǎn)品，批號4970S；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒，美國Thermo公司產(chǎn)品，批號UD281582； HRP 標記的羊抗兔 Ig G二抗，美國thermo公司產(chǎn)品，批號G-21234。蛋白電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像分析儀，美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；多功能酶標板分析儀，美國PerkinElmer公司產(chǎn)品；Heracell-150型CO2培養(yǎng)箱、MSC1.2型生物安全柜，美國Thermo公司產(chǎn)品；IX73型倒置熒光顯微鏡，日本 Olympus 公司產(chǎn)品；Lightcycler 96型熒光定量PCR 儀，瑞士Roche 公司產(chǎn)品。

1.3 檢測指標

1.3.1 HCT116增殖能力

采用CCK-8實驗方法檢測。取對數(shù)生長期的HCT116用胰酶消化，制成單細胞懸液(5×104個/mL)，均勻接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，每孔加入200 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液(空白組)或含蟾毒靈培養(yǎng)液(0.125,0.25,0.5,1,2 μmol/L)，并設(shè)野生型細胞對照組，每組5個復孔。繼續(xù)孵育培養(yǎng)24，48，72 h后，加入CCK-8試劑 20 μL反應2 h，酶標儀上在波長450 nm 處測定每孔吸光度 (optical density,OD)值，取復孔平均OD值進行統(tǒng)計，按以下公式計算細胞增殖率。細胞增殖率=藥物組OD值/對照組OD值。

1.3.2 HCT116侵襲和遷移能力

采用Transwell檢測。取人工基底膜Matrigel膠，按Matrigel∶空培養(yǎng)基=1∶8的比例制備成無血清基底膜膠混合物，均勻覆蓋于Transwell 小室的上室內(nèi)，每孔50 μL，放于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，2 h后凝固待用(遷移實驗不提前包被Matrigel膠)。按對照組、蟾毒靈(0.25,0.5, 1 μmol/L)組和順鉑組(2 mg/L)取1×105個對數(shù)期生長的HCT116稀釋至200 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于上室，下室加入含體積分數(shù)為100 mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基500 μL。每一組細胞均設(shè)5個復孔。培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室并用提前預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS) 輕輕沖洗2遍，用棉簽輕輕擦去上室表面的細胞。濾膜在質(zhì)量分數(shù)為40 g/L 多聚甲醛溶液中固定20 min，在室溫下用質(zhì)量分數(shù)為1 g/L的結(jié)晶紫染液染色15 min，PBS清洗3遍，自然風干，于光學顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)量。隨機選取5個視野，計算平均值。

1.3.3 MMP-2和TIMP-2的蛋白表達水平

采用Western blot檢測。取對數(shù)期HCT116經(jīng)胰酶消化后接種于6孔板中，細胞貼壁后(24 h)按對照組、蟾毒靈(0.25，0.5，1 μmol/L)組和順鉑組(2 mg/L)加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min, 4 ℃ 離心20 min,提取細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定后制備樣品。接著進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件為70V 恒壓 60 min，120 V恒壓電泳20 min；將膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA恒流90 min；用TBST洗膜3次，每次10 min；用質(zhì)量分數(shù)為50 g/L的脫脂奶粉溶液室溫封閉1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。按推薦稀釋比稀釋一抗抗體，將膜放置于一抗中4 ℃孵育過夜，復溫1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min。按推薦稀釋比稀釋二抗抗體(HRP 標記的羊抗兔)室溫下繼續(xù)孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后按1∶1配制ECL顯影液，采用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶，并用灰度分析軟件定量分析。

1.3.4 MMP-2和TIMP-2的mRNA水平

采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測。首先按1.3.3項下步驟進行分組與加藥，繼續(xù)孵育24 h后提取每組細胞總RNA。MMP-2、 TIMP-2和β-actin引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。反應條件：預變性溫度 95 ℃ 6 min；解鏈溫度95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s，擴增溫度95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 10 s進行45個循環(huán)。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組人結(jié)腸癌HCT116增殖率對比

與對照組同一時間點對比，蟾毒靈處理24，48，72 h后，人結(jié)腸癌HCT116增殖情況受到明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并呈一定的濃度依賴性。見表2。根據(jù)蟾毒靈對HCT116增殖抑制的情況，為保證一定的有效性，并且排除蟾毒靈毒性對結(jié)腸癌細胞侵襲遷移實驗的干擾，后續(xù)實驗選用適中濃度(0.25,0.5,1 μmol/L)的蟾毒靈作用24 h進行研究。

組 別藥物濃度/(μmol·L-1)檢測時間點24 h48 h72 h對照組-99.33±2.08100.00±2.0099.67±3.51蟾毒靈組0.12586.37±6.03??51.63±5.00??28.95±3.51??0.2585.41±5.00??45.16±5.03??28.29±8.54??0.574.04±5.00??40.37±5.00??24.83±4.04??144.28±5.03??45.38±6.11??27.50±3.51??231.52±6.56??32.23±10.00??23.34±3.61??

注：與同一時間點對照組對比， **P<0.01。

2.2 各組人結(jié)腸癌HCT116侵襲和遷移能力對比

與對照組對比，蟾毒靈(0.25,0.5,1 μmol/L)處理24 h后，HCT116的侵襲和遷移明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。順鉑組的抑制侵襲和遷移能力最強，提示順鉑組具有陽性對照功能。1 μmol/L蟾毒靈組的抑制侵襲和遷移能力與順鉑組接近。見表3。

組 別藥物濃度/(μmol·L-1)侵襲數(shù)目/個 遷移數(shù)目/個對照組-256.60±21.01329.67±27.57順鉑組2 mg·L-152.00±4.53??140.00±17.69??蟾毒靈組0.25178.00±40.62??241.33±19.66??0.5108.00±14.71??231.33±9.50??176.60±8.41??180.33±12.66??

注：與對照組對比，**P<0.01。

2.3 各組人結(jié)腸癌HCT116 MMP-2、TIMP-2 蛋白表達對比

HCT116經(jīng)蟾毒靈(0.25,0.5,1 μmol/L)及順鉑(2 mg/L)處理24 h后，與對照組對比， MMP-2蛋白表達下降，TIMP-2 蛋白表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；蟾毒靈組呈濃度依賴性。見表4。

組 別藥物濃度/(μmol·L-1)MMP2/β-actinTIMP2/β-actin對照組-1.54±0.101.05±0.15順鉑組2 mg·L-10.47±0.10??1.93±0.11??蟾毒靈組0.251.31±0.08?1.26±0.200.51.08±0.10??1.69±0.05??10.16±0.10??1.83±0.05??

注：與對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各組人結(jié)腸癌HCT116 MMP-2、TIMP-2的mRNA表達水平對比

HCT116經(jīng)蟾毒靈(0.25,0.5,1 μmol/L)及順鉑(2 mg/L)處理24 h后，與對照組對比， MMP-2的mRNA表達下降，TIMP-2的mRNA表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；蟾毒靈組呈濃度依賴性。見表5。

組 別藥物濃度/(μmol·L-1)MMP-2 mRNA/β-actinTIMP-2 mRNA/β-actin對照組-1.00±0.011.00±0.01順鉑組2 mg·L-10.72±0.06??1.71±0.14??蟾毒靈組0.250.75±0.09??1.32±0.06??0.50.48±0.05??1.41±0.08??10.39±0.05??1.62±0.05??

注：與對照組對比， **P<0.01。

3 討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)又稱基質(zhì)素，具有水解細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，在細胞生物活動中發(fā)揮多種關(guān)鍵作用，如胚胎發(fā)育、正常組織的重塑、創(chuàng)傷修復,以及血管生成，涉及動脈硬化。關(guān)節(jié)炎、潰瘍及腫瘤的形成與發(fā)展[10]。其中，MMP-2在腫瘤的侵襲與遷移過程中的作用尤為關(guān)鍵[11]。研究表明,細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)不僅僅是細胞骨架，還是許多生物活性分子的貯存庫。當ECM被MMPs降解時，胞外基質(zhì)會釋放眾多生長因子，這些因子能夠改變細胞表型。對于腫瘤細胞來說，獲得具有侵襲性的細胞表型能夠促使腫瘤細胞發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移[12-13]。TIMPs是MMPs的天然特異性抑制劑，核磁共振成像技術(shù)從結(jié)構(gòu)上解釋了TIMPs的完整結(jié)構(gòu)與抑制機制，TIMPs的整體形狀就像一個楔子，能嵌入MMPs的活性位點裂隙中，并以類似底物的方式發(fā)揮抑制作用[14]。MMPs/TIMPs系統(tǒng)是腫瘤侵襲與遷移的關(guān)鍵調(diào)控系統(tǒng)，兩者之間的平衡關(guān)系維持著ECM的穩(wěn)定，并且TIMPs的異常表達與腸癌預后關(guān)系緊密[15]。

本實驗中，筆者通過CCK-8實驗檢測了蟾毒靈對HCT116的增殖抑制能力，結(jié)果顯示蟾毒靈對HCT116的抗增殖作用呈現(xiàn)明顯的時間與劑量依賴性。為了避免高濃度、長時間的藥物處理所引發(fā)的細胞死亡，后續(xù)實驗筆者選擇0.25,0.5,1 μmol/L蟾毒靈處理24 h來研究其對HCT116的抗侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。Transwell結(jié)果顯示，蟾毒靈能夠有效抑制HCT116的侵襲與遷移，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。在作用機制上，筆者檢測了MMP-2和TIMP-2的蛋白表達與mRNA表達情況。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)蟾毒靈處理后，HCT116的MMP-2的蛋白表達水平下調(diào)，其天然抑制因子TIMP-2的蛋白表達水平上調(diào)。因此，筆者認為，蟾毒靈很可能是通過調(diào)節(jié)MMP-2蛋白水平抑制了結(jié)腸癌細胞的侵襲與遷移，其機制很可能是通過上調(diào)TIMP-2的表達實現(xiàn)的。進一步檢測mRNA水平的變化，結(jié)果顯示，經(jīng)蟾毒靈處理的HCT116的TIMP-2的mRNA水平上調(diào)，說明蟾毒靈能夠提高TIMP-2的轉(zhuǎn)錄，進而提高蛋白表達，并下調(diào)MMP-2的表達。

綜上所述，本實驗揭示了蟾毒靈抑制人腸癌細胞侵襲與遷移的新機制，即蟾毒靈通過上調(diào)TIMP-2的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)蛋白表達，而TIMP-2蛋白表達水平增高又可抑制MMP-2的蛋白表達，進而發(fā)揮抑制人結(jié)腸癌細胞侵襲與遷移的作用。蟾毒靈調(diào)控TIMP-2的mRNA的機制還有待進一步研究，其中蟾毒靈與TIMP-2分子的構(gòu)效關(guān)系值得深入研究。