傅志勤 施亮 景方圓 周陳西 諸一鳴 聞強(qiáng) 楊悅 李培偉

卵巢癌是威脅婦女生命的第一“殺手”[1]。據(jù)2018年的報(bào)道統(tǒng)計(jì)全球每年有22萬患者死于卵巢癌，同時(shí)，目前全球每年有23萬患者被診斷為卵巢癌，并有逐年增長的趨勢(shì)[2]。由于卵巢癌發(fā)病隱秘，約80%患者就診時(shí)腫瘤的病理分期處于中晚期，盡管手術(shù)技術(shù)及化療手段均不斷提升，仍無法突破卵巢癌5年生存率只有30%的窘境[3]。

薈萃文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞的高遷移、侵襲、抗凋亡能力均與患者的不良預(yù)后直接關(guān)聯(lián)[4-6]。研究表明，腫瘤細(xì)胞極性與其遷移、侵襲、抗凋亡的能力密切相關(guān)[7]。已有研究表明，密封蛋白（Claudin）是細(xì)胞維持極性的關(guān)鍵蛋白，Claudin的基因表達(dá)和定位經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生改變[8]。目前已有研究表明，不同Claudin家族成員的基因過表達(dá)可以分別導(dǎo)致肺癌[9]、乳腺癌[10]、胃癌[11]、大腸癌[12]等多種腫瘤的不良預(yù)后。

目前已有研究報(bào)道，Claudin1、3、4的基因表達(dá)水平在卵巢癌正常組織及癌組織中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此有研究基于上訴背景推測(cè)Claudin家族可能也參與了卵巢癌發(fā)展進(jìn)程[13]。那么Claudin家族成員的基因表達(dá)水平是否與卵巢癌預(yù)后相關(guān)呢？因此，本研究擬通過分析公共數(shù)據(jù)庫資源初步探索Claudin家族基因表達(dá)水平與其在卵巢癌疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料和方法

1.1 基因譜芯片篩選、數(shù)據(jù)清洗及分組 通過檢索Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫檢索選取含有正常卵巢組織及卵巢癌組織(包含分期信息)，并對(duì)符合條件的芯片采用R語言affyPLM數(shù)據(jù)包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行回歸分析判斷，并進(jìn)行歸一化處理，得到符合質(zhì)量要求芯片 GSE66957、GSE9891、GSE14764 和 GSE26712。并將Claudin家族各基因分別分為正常卵巢組、卵巢癌早期組（以分期Ⅱ期及以下為早期）和卵巢癌晚期組（以分期Ⅱ期以上為晚期）3組。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。使用Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫對(duì)在正常卵巢組織、早期卵巢癌及晚期卵巢癌之間兩兩比較表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Claudin家族基因進(jìn)行預(yù)后（overall survival，OS）及復(fù)發(fā)（progression-free survival，PFS）分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Claudin家族基因表達(dá)水平在正常卵巢組織及早、晚期卵巢癌的差異分析 本次研究芯片主要來源于GSE66957、GSE9891、GSE14764 和 GSE26712 共計(jì) 546個(gè)樣本（其中正常卵巢組織22個(gè)、癌組織524個(gè)），包含Claudin 家族基因成員 1～7、9～11、14～20 共計(jì) 17 個(gè)成員。在正常卵巢組織、早期卵巢癌及晚期卵巢癌表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因?yàn)?個(gè)，分別為Claudin1、4、6、7、10、14、18 基因（均 P＜0.05）。

Claudin家族基因在不同組織基因表達(dá)水平具有臨床異質(zhì)性，如正常卵巢與卵巢癌組織共同基因表達(dá)的Claudin 家族基因主要為 Claudin1、3～7、10～11、14～15、18～19基因。而正常卵巢不表達(dá) Claudin 9、16、17、20 基因，早期卵巢癌組織不表達(dá)Claudin 2、16、17基因，晚期卵巢癌組織不表達(dá)Claudin 2基因，見表1、2，圖1（插頁）。

表1 芯片信息

表2 Claudin家族在正常卵巢組織、早期卵巢癌及晚期卵巢癌中的基因表達(dá)水平差異

2.2 Claudin家族基因表達(dá)水平與預(yù)后及復(fù)發(fā)的分析通過 Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫對(duì) Claudin1、4～7、10、14、18基因進(jìn)行 OS及 PFS分析發(fā)現(xiàn)，Claudin7、14的基因表達(dá)水平對(duì)卵巢癌的PFS具有顯著性影響（P=0.0456、0.0247）。同時(shí)，Claudin4、6、10 的基因表達(dá)水平對(duì)卵巢癌的OS具有顯著性影響（P=0.0265、0.0296、0.0278），見圖 2、3（插頁）。

3 討論

密蛋白Claudin家族屬于緊密連接蛋白，對(duì)維持上皮細(xì)胞極性、細(xì)胞旁通透性起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin家族可以通過募集細(xì)胞信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及發(fā)展[14]。目前已發(fā)現(xiàn)，Claudin家族成員Claudin1～14基因在多種腫瘤包括前列腺癌[15]、子宮內(nèi)膜癌[16]和乳腺癌[10]中過表達(dá)，并且其與患者不良預(yù)后呈顯著相關(guān)。如高表達(dá)的Claudin 3基因與肺癌的不良預(yù)后相關(guān)[9]，低表達(dá)的Claudin 2基因與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)[10]，Claudin 4基因的過表達(dá)與大腸癌及胃癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[11-12]。提示Claudin家族成員可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，Claudin家族成員的基因過表達(dá)可能存在腫瘤特異性，其個(gè)別成員的基因過表達(dá)是某些腫瘤的不良預(yù)后的標(biāo)志物。卵巢癌領(lǐng)域亦有研究報(bào)道Claudin1～10基因的過表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[15]。目前Claudin家族成員已發(fā)現(xiàn)達(dá)20多位，隨著Claudin家族成員與腫瘤發(fā)生的關(guān)注度增高，Claudin14基因也被發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)與其他腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。

本次研究首次采用GEO及Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫探索Claudin家族成員過表達(dá)與卵巢癌疾病發(fā)展進(jìn)展中的作用，不僅發(fā)現(xiàn) Claudin1、4、6、7、10、14、18 基因在正常卵巢組織、早期卵巢癌及晚期卵巢癌表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，Claudin7、14的基因表達(dá)水平對(duì)卵巢癌的PFS具有顯著性影響，Claudin4、6、10的基因表達(dá)水平對(duì)卵巢癌的OS具有顯著性影響。這一結(jié)果再次證實(shí)了Claudin1、4～7基因通過不同方式參與卵巢癌疾病發(fā)展。如Claudin 1基因通過Ras-Raf-1-ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)軸誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[19-20]；Claudin 6、7基因通過增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）活性及血管生成作用從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[21]；Claudin 4基因過表達(dá)可能通過抑制化療藥物滲入卵巢癌組織，從而產(chǎn)生化療耐藥而導(dǎo)致不良預(yù)后[22]；Claudin5基因主要參與血管通透性調(diào)節(jié)，并與卵巢癌腹水形成有密切聯(lián)系[18，23]。

同時(shí)，本研究結(jié)果也證實(shí)了Claudin10、14基因的過表達(dá)不僅與卵巢癌發(fā)生相關(guān)，也進(jìn)一步顯示了其在卵巢癌預(yù)后及復(fù)發(fā)具有重要臨床價(jià)值，為探究Claudin10、14基因?qū)е侣殉舶┗颊吣[瘤復(fù)發(fā)及不良預(yù)后的分子機(jī)制提供了一個(gè)研究方向。后期本研究團(tuán)隊(duì)將基于本研究結(jié)果進(jìn)一步探究Claudin家族特定成員如何調(diào)控卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后復(fù)發(fā)的作用機(jī)制，逐步闡明其分子機(jī)理，為卵巢癌的治療奠定充足的理論依據(jù)。

圖1 Claudin家族在正常卵巢組織，早期卵巢癌及晚期卵巢癌中的基因表達(dá)水平差異可視化-盒須圖（stage0:正常卵巢組織；stage1:早期卵巢癌組織；stage2:晚期卵巢癌組織）

圖2 Claudin家族的基因表達(dá)水平與卵巢癌的PFS曲線

圖3 Claudin家族的基因表達(dá)水平與卵巢癌的OS曲線