麥浩彬，郭鑫偉，王金港，遲淑艷、2*，董曉慧、2、3，楊奇慧、2，劉泓宇、2，章雙、2

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088； 2.廣東省水產(chǎn)動物精準(zhǔn)營養(yǎng)與高效飼料工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

蛋白質(zhì)是飼料中最昂貴的成分，直接影響飼料成本，制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，為此尋求一個(gè)既節(jié)約成本又能保證魚類快速生長的營養(yǎng)方案對優(yōu)化魚類養(yǎng)殖業(yè)至關(guān)重要[1]。魚類生長主要是體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積，而魚體規(guī)格和蛋白質(zhì)的種類均會影響其需求量。大量研究證實(shí)，飼料蛋白質(zhì)水平為40%～56%時(shí)，可促進(jìn)石斑魚健康快速生長[2-4]。早期研究發(fā)現(xiàn)，以體質(zhì)量特定增長率為評價(jià)指標(biāo)，經(jīng)線性模型得出珍珠龍膽石斑魚幼魚(初始體質(zhì)量為6.50 g±0.00 g)最適蛋白質(zhì)需求量為51.57%[5]。適宜的蛋白質(zhì)水平不僅可以增強(qiáng)動物自身免疫力、改善機(jī)體腸道組織形態(tài)[6-7]，還可優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境[8-9]，從而提高魚體增重率。

高蛋白質(zhì)日糧投喂斷奶仔豬會抑制腸絨毛生長，從而提高仔豬腹瀉率，而適當(dāng)降低日糧蛋白質(zhì)水平并補(bǔ)充主要氨基酸則有利于改善腸道健康，從而促進(jìn)機(jī)體生長[10]，飼料蛋白質(zhì)水平能夠調(diào)節(jié)水貂空腸各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)[11]。此外，作為宿主的一個(gè)組成部分的腸道微生物群落也受到飼料蛋白質(zhì)水平影響。珍珠龍膽石斑魚Epinepheluslanceolatu♂×Epinephelusfuscoguttatus♀是由鞍帶石斑魚E.lanceolatu♂和棕點(diǎn)石斑魚E.fuscoguttatus♀雜交而來，具有肉質(zhì)鮮美、生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高和發(fā)展?jié)摿Υ蟮忍攸c(diǎn)[12]。目前的研究表明，石斑魚腸道菌群組成受水體環(huán)境[13]、攝食類型[14]、不同生長階段[15]、禁食和攝食[16]等因素的影響，但關(guān)于飼料蛋白質(zhì)水平對珍珠龍膽石斑魚腸道形態(tài)和腸道菌群的影響尚未見報(bào)道。本研究中，通過評估珍珠龍膽石斑魚攝入不同水平蛋白質(zhì)飼料后的腸道形態(tài)及其腸道菌群結(jié)構(gòu)，以期了解飼料蛋白質(zhì)水平對石斑魚腸道微生態(tài)群落的影響，為龍膽石斑魚飼料的開發(fā)及其增養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚珍珠龍膽石斑魚幼魚購自廣東省雷州市石斑魚苗場。試驗(yàn)用水為經(jīng)過沉淀、沙濾的天然海水。維生素預(yù)混料和礦物質(zhì)預(yù)混料由青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料配制 以紅魚粉和酪蛋白為蛋白源，魚油和豆油為脂肪源，高筋面粉和玉米淀粉為碳水化合物源，配制6組蛋白質(zhì)水平分別為35%、40%、45%、50%、55%、60%的等脂等能飼料(記為P35、P40、P45、P50、P55和P60組)，所有原料經(jīng)粉碎后過60目篩，按飼料配方(表1)準(zhǔn)確稱取后攪拌均勻，微量組分采取逐級擴(kuò)大法混合均勻，再通過V型立式混合機(jī)(浙江正泰電器股份有限公司，JS-14S型)充分混勻，加入預(yù)先稱取并混合好的魚油和豆油，邊攪拌邊添加適量的水，用雙螺桿擠條機(jī)(華南理工大學(xué)，F(xiàn)-75型)制成粒徑為2.5 mm的顆粒飼料。自然風(fēng)干至水分含量為10%左右時(shí)，用封口袋分裝后置于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料配方和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
Tab.1 Ingredients and nutrient levels of the test diets (air-dry basis)

w/%

注：原料中還包括紅魚粉 38.00%，高筋面粉 16.00%，魚油 4.30%，豆油 4.30%，氯化膽堿 0.30%，磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.00%，維生素預(yù)混料 0.30%，礦物質(zhì)預(yù)混料 0.70%，維生素C 0.05%，乙氧基喹啉 0.03%，誘食劑 0.10%

Note: The other ingredients include brown fish meal of 38.00%,bread flour 16.00%,fish oil 4.30%,soybean oil 4.30%,choline chloride 0.30%,Ca(H2PO4)21.00%,vitamin premix 0.30%,mineral premix 0.70%,vitamin C 0.05%,ethoxyquin 0.03%,and attractant 0.10%

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 將珍珠龍膽石斑魚幼魚在室內(nèi)玻璃鋼桶(1 m3)中馴化10 d，期間投喂石斑魚商業(yè)配合飼料(廣東上上生物科技有限公司，粗蛋白質(zhì)≥49%，粗脂肪≥8%)。待石斑魚穩(wěn)定并適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后，挑選健康、規(guī)格一致的試驗(yàn)魚(體質(zhì)量為6.50 g±0.00 g)隨機(jī)分配到18個(gè)養(yǎng)殖桶中，養(yǎng)殖8周。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理組，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚，分別投喂6種不同蛋白質(zhì)含量的試驗(yàn)飼料。每天飽食投喂兩次(8:00和16：00)。養(yǎng)殖試驗(yàn)在國家(863)項(xiàng)目海水養(yǎng)殖種子工程南方基地進(jìn)行。

養(yǎng)殖期間，水溫為28～30 ℃，海水鹽度為27～29，不間斷充氧氣，溶解氧≥5 mg/L，氨氮含量≤0.03 mg/L。定期清洗玻璃鋼桶，并定時(shí)觀察石斑魚攝食情況，根據(jù)攝食情況及時(shí)調(diào)整，記錄投喂量和魚體死亡情況。

1.2.3 樣品采集與處理 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁飼24 h后取樣。將石斑魚用丁香酚(1∶10 000)麻醉后，從每個(gè)重復(fù)取2尾魚解剖，取其腸道并分為前腸、中腸和后腸分別置于10%甲醛溶液中，用于制作腸道切片；再從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取3尾魚，用75%酒精擦拭體表，用無菌解剖剪剪開腹部，取出腸道，用0.9%的無菌生理鹽水沖洗腸道外壁，置于-80 ℃下保存用于菌落分析。

1.2.4 DNA提取及PCR擴(kuò)增 根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；用338-F(5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和806-R(5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′)引物對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性3 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行27個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min(PCR儀，ABI GeneAmp?9700型)。PCR擴(kuò)增體系(共20L)包含：4L 5×FastPfu 緩沖液，2L 2.5 mmol/L dNTPs，0.8L引物(5mol/L)，0.4L FastPfu 聚合酶，10 ng DNA模板。

1.2.5 MiSeq測序及指標(biāo)計(jì)算 使用20 g/L瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化，用Tris-HCl洗脫，洗脫后用連接“Y”接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集并以0.1 mol/L氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，構(gòu)建測序文庫后，在Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

數(shù)據(jù)分析流程：原始數(shù)據(jù)→連接質(zhì)控→優(yōu)化數(shù)據(jù)→OUT聚類→數(shù)據(jù)分析與信息挖掘。

使用UPARSE軟件(Version 7.1，http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類，利用RDP classifier (http://rdp.cme. msu.edu/)對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設(shè)置比對閾值為70%。 利用香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)、Ace和Chao指數(shù)評估各組細(xì)菌多樣性和豐富度。

1.2.6 H.E染色、切片 取用10%甲醛固定好的珍珠龍膽石斑魚前腸、中腸和后腸樣本，分別常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為6m，用蘇木精-伊紅(H.E)染色，在4倍全自動生物顯微鏡(DM600)下觀察和拍照，每張切片分別用體視顯微鏡(SZX7)測定10個(gè)點(diǎn)的皺襞高度(PH)、皺襞寬度(PW)、隱窩深度(CD)和肌層厚度(MT)數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠龍膽石斑魚腸道組織形態(tài)的變化

從圖1可見：前腸中，飼料蛋白質(zhì)水平超過45%時(shí)，肌層厚度明顯變大，P50組皺襞比其他組更加濃密；中腸中，P50組皺襞發(fā)育明顯比其他組好，皺襞高且規(guī)則，而P40、P55和P60組與其他組相比，皺襞相對較短，形狀不規(guī)則；后腸中，P35和P40組皺襞出現(xiàn)脫落、變形，隨著蛋白質(zhì)水平升高其現(xiàn)象略有改善，在P50組獲得良好效果，而隨后皺襞又開始變得稀疏、變形且開始有損傷。

從表2可見：前腸中，P50和P55組皺襞高度顯著高于其他組(P<0.05)，P50組皺襞寬度顯著低于除P60組外的其他組(P<0.05)，隱窩深度各組間并無顯著性差異(P>0.05)，皺襞高度與隱窩深度的比值中，P55組顯著高于P35和P40組(P<0.05)，P50、P55和P60組肌層厚度顯著高于P35、P40和P45組(P<0.05)；中腸中，各組皺襞高度并未見顯著性差異(P>0.05)，P50組的皺襞寬度顯著低于P35和P40組(P<0.05)，P50組隱窩深度顯著低于P45組(P<0.05)，P45組皺襞高度與隱窩深度的比值顯著低于其他組(P<0.05)，P50組肌層厚度顯著高于除P40組外的其他組(P<0.05)；后腸中，P50和P55組皺襞高度顯著高于P40、P45和P60組(P<0.05)，P50組皺襞寬度和隱窩深度顯著低于P35組(P<0.05)，P50組皺襞高度與隱窩深度的比值顯著高于除P55組外的其他組(P<0.05)，P50和P55組肌層厚度顯著高于P45組(P<0.05)。

表2 珍珠龍膽石斑魚腸道顯微指標(biāo)

注：同列中標(biāo)有不同字母表示同一組織不同組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences in different groups in same tissue (P<0.05), and the means with the same letters within the same column are not significant differences(P>0.05), et sequentia

2.2 珍珠龍膽石斑魚腸道微生物多樣性的變化

2.2.1 Alpha多樣性分析 從表3可見：各試驗(yàn)組間基于Ace指數(shù)的Alpha多樣性無顯著性差異(P>0.05)；P55和P60組Chao指數(shù)顯著高于P40、P45和P50組(P<0.05)；各組間Shannon和Simpson的多樣性指數(shù)分別為4.02～4.95、0.03～0.04，不同蛋白質(zhì)水平對石斑魚幼魚腸道細(xì)菌多樣性無顯著性影響(P>0.05)；各組Coverage指數(shù)均在0.99以上，說明未被檢測細(xì)菌可能性較少。

2.2.2 腸道菌落結(jié)構(gòu)組成 門水平上定義相對豐度≥10%為占主導(dǎo)地位的細(xì)菌群。石斑魚腸道菌群優(yōu)勢門依次為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes和擬桿菌門Bacteroidetes，且總含量均高于85%。變形菌門在P50組含量最低，在其他組均較高；放線菌門在P45組含量最高，在其他組均有所下降且蛋白質(zhì)水平超過50%時(shí)逐漸降到穩(wěn)定水平；蛋白質(zhì)含量超過45%時(shí)，厚壁菌門和擬桿菌門含量均有所升高，其中P50組含量較高(表4)。

在屬水平上，紅球菌屬Rhodococcus、羅爾斯通菌屬Ralstonia和不動桿菌屬Acinetobacter是腸道細(xì)菌群落中最具優(yōu)勢的3個(gè)屬。從表5可見：紅球菌屬含量在各組中均為最高，P40和P45組分別高達(dá)31.77%和41.51%，而其他組只占14%～24%；各組羅爾斯通菌屬數(shù)值上差異不大；蛋白質(zhì)含量超過45%時(shí)，不動桿菌屬含量均有所下降，其中 P50組含量最低；假單胞菌屬在P40組含量最高，在P60組含量最低，而在其他組差異不大；乳酸桿菌屬則在P50組中含量最高，在其他組含量均有所下降；P45和P50組未檢測到互營桿菌屬細(xì)菌。

以樣品的OUT數(shù)為依據(jù)構(gòu)建Venn圖，比較分析P35、P50和P60組間細(xì)菌多樣性。從圖2可見：3個(gè)處理組克隆樣品OUT數(shù)分別為310、294和409，總數(shù)為1013，其中有153個(gè)共同OUT，占總數(shù)15.10%；P35、P50和P60組單獨(dú)具有的OUT數(shù)分別為59、54和119，分別占總數(shù)的5.82%、5.33%和11.74%；P35與P50、P35與P60、P50與P60組共有OUT數(shù)分別為177、277和216，分別占其中兩組總數(shù)的29.30%、38.53%和30.73%。這顯示了以不同蛋白質(zhì)水平的飼料喂養(yǎng)珍珠龍膽石斑魚，對其腸道結(jié)構(gòu)影響具有一定的相似性，盡管相似性高，但各組在多樣性中均有一定的差異性。

表4 珍珠龍膽石斑魚腸道中門水平細(xì)菌種群及含量

Tab.4 Communities and relative abundance of bacteria in the intestine of juvenile pearl gentian grouper at the level of phylum%

組別group變形菌門Proteobacteria放線菌門Actinobacteria厚壁菌門Firmicutes擬桿菌門Bacteroidetes梭桿菌門Fusobacteria互養(yǎng)菌門Synergistetes綠彎菌門Chloroflexi螺旋菌門Spirochaetae未分類菌unidentified bacteria異常球菌Deinococcus-ThermusP3545.4627.2513.045.870.630.980.760.620.711.11P4044.7335.6911.583.210.080.510.430.860.700.17P4534.5145.2012.173.561.420.000.270.010.181.12P5027.7224.1929.5511.133.030.000.150.120.320.51P5536.4520.5018.989.401.322.821.981.780.750.83P6032.8120.5919.2413.564.411.031.031.001.680.22

表5 珍珠龍膽石斑魚腸道中屬水平細(xì)菌種群及含量

Tab.5 Communities and relative abundance of bacteria in the intestine of juvenile pearl gentian grouper at the level of genus%

組別group紅球菌屬Rhodococcus羅爾斯通菌屬Ralstonia不動桿菌屬Acinetobacter假單胞菌屬Pseudomonas大腸桿菌-志賀菌屬Escherichia-shigella擬桿菌目S24-7群S24-7_groupin Bacteroidales擬桿菌屬Bacteroides互營桿菌屬Syntrophobacter乳酸桿菌屬Lactobacillus未分類毛螺菌科unidentified bacteria inLachnospiraceaeP3523.785.877.684.261.941.511.851.40.750.59P4031.777.758.046.253.411.020.271.820.290.58P4541.517.576.284.514.601.171.7002.601.27P5019.086.173.054.073.665.391.7904.482.48P5515.836.035.244.762.013.731.095.522.701.65P6014.724.944.102.422.581.456.953.261.192.79

3 討論

3.1 飼料蛋白質(zhì)水平對珍珠龍膽石斑魚腸道組織形態(tài)的影響

腸道隱窩深度、肌層厚度，以及皺襞的高度、寬度和疏密程度等是衡量動物消化吸收能力的重要指標(biāo)。腸道隱窩是腸壁凹陷的結(jié)構(gòu)，隱窩深度影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的能力；皺襞越高越寬越濃密，表明腸道吸收表面積越大，越有利于提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率；肌層厚度則表示腸壁肌肉收縮能力，收縮能力強(qiáng)則有利于物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸[17-18]。適宜的飼料蛋白質(zhì)水平有利于優(yōu)化畜禽腸道結(jié)構(gòu)，改善腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收消化能力，從而促進(jìn)機(jī)體生長[19]。然而，飼料蛋白質(zhì)水平對海水魚類腸道組織形態(tài)學(xué)的影響研究報(bào)道較少，本試驗(yàn)中，50%飼料蛋白質(zhì)水平組魚體腸道皺襞高度、密度均優(yōu)于其余各組，該水平下石斑魚增重率最高[5]。類似結(jié)果在建鯉[20]和團(tuán)頭魴[21]中也被發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)為飼料蛋白質(zhì)水平顯著影響魚類腸道皺褶的發(fā)育，且皺褶高度和腸道絨毛密度與其生長表現(xiàn)出一致的變化趨勢，提示飼料蛋白質(zhì)水平對魚類腸道發(fā)育的影響可能與其生長直接相關(guān)。另外，本試驗(yàn)表明，適宜的蛋白質(zhì)水平還能增大腸道皺襞高度與隱窩深度的比值和肌層厚度值。皺襞高度與隱窩深度的比值與腸道功能密不可分，是體現(xiàn)腸道黏膜分化程度的標(biāo)志，其數(shù)值越大表示消化吸收能力越強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，飼料蛋白質(zhì)水平改善皺襞高度與隱窩深度的比值主要表現(xiàn)在前腸和后腸的P50和P55組。蛋白質(zhì)水平超過45%時(shí)，前腸肌層厚度值顯著升高，在P50組達(dá)到最大值，此后隨蛋白質(zhì)水平升高，肌層厚度值略有下降；P50組中腸肌層厚度值雖與P40組相比無顯著性差異，但卻顯著高于其他組；P50和P55組后腸肌層厚度值顯著高于P45組。綜上所述，P50組腸道形態(tài)發(fā)育較之其他組好，皺襞高度與隱窩深度的比值和肌層厚度值均保持在高水平下。因此，魚體攝入的蛋白質(zhì)水平適宜時(shí)，可以較好地改善腸道形態(tài)發(fā)育，促進(jìn)消化吸收機(jī)能，更好地滿足生長。

3.2 飼料蛋白質(zhì)水平對珍珠龍膽石斑魚腸道菌群組成的影響

腸道有益菌屬可通過改善宿主免疫調(diào)節(jié)功能、營養(yǎng)吸收能力和內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)能力來促進(jìn)宿主生長[22]，而有害菌屬則會增加腸道黏膜層的通透性，從而導(dǎo)致細(xì)菌和其他大分子穿過黏膜屏障[23]。因此，建立良好的腸道微生態(tài)系統(tǒng)對于魚類健康生長至關(guān)重要。

從門水平上看，本試驗(yàn)各組并未出現(xiàn)新的優(yōu)勢菌種，飼料蛋白質(zhì)水平雖然不同，但各組優(yōu)勢菌群種類相同，只是其數(shù)量有所改變。有研究指出，脊椎動物尤其是哺乳動物的優(yōu)勢菌門為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門[24]，本研究結(jié)果顯示，珍珠龍膽石斑幼魚腸道優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，與飼料蛋白質(zhì)水平對卵形鯧鲹[8]腸道優(yōu)勢菌群的研究結(jié)果相似。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，普遍存在于海洋生物腸道之中，是羅非魚腐敗過程中的優(yōu)勢菌門[25]，其含量過高會破壞腸道微生態(tài)環(huán)境，增加機(jī)體患病可能性[26]。放線菌門屬于條件致病菌，其中某些營腐生生活菌可分泌許多胞外酶和次生代謝產(chǎn)物等物質(zhì)參與自然界氮素循環(huán)，而某些放線菌卻為致病菌，可在機(jī)體免疫能力低的時(shí)候侵染機(jī)體，產(chǎn)生慢性或亞急性疾病[27]。厚壁菌門在宿主腸道中被認(rèn)為是促進(jìn)纖維素分解[28]和幫助多糖發(fā)酵[29]的重要菌群。擬桿菌門則與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等有機(jī)物的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，并參與糖類、膽汁酸和類固醇代謝[30]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，P50組變形菌門和放線菌門含量有所降低，厚壁菌門和擬桿菌門含量有所升高，這有利于促進(jìn)機(jī)體腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換和吸收。有研究指出，厚壁菌門與擬桿菌門的比值與動物肥胖相關(guān)，但究竟是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)至今仍存在爭議[31-32]，這可能是由于物種差異或機(jī)體的自身健康狀況所致。本試驗(yàn)中厚壁菌門與擬桿菌門的比值隨飼料蛋白質(zhì)水平的升高呈先升后降趨勢，在P40組達(dá)到最大值，P60組達(dá)到最小值，其趨勢與全魚粗脂肪含量隨蛋白質(zhì)水平變化的趨勢一致[7]，這也驗(yàn)證了厚壁菌門與擬桿菌門的比值影響脂代謝，由此猜想魚體增重率提高的原因可能是脂肪對蛋白質(zhì)起了節(jié)約作用。另外，蛋白質(zhì)含量過低(P35組)或過高(P60組)，有益菌含量減少而變形菌門含量增多(相對P50組)，這可能是由于變形菌門適應(yīng)性較強(qiáng)，在低蛋白質(zhì)環(huán)境下仍能爭奪大量營養(yǎng)用于自身繁殖，并競爭大量的腸道黏附位點(diǎn)，從而導(dǎo)致有益菌含量減少。另一方面，機(jī)體分解腸道中高蛋白質(zhì)飼料會加劇消化器的負(fù)擔(dān)，長久的積累可能會造成系統(tǒng)缺陷，最終導(dǎo)致致病菌侵入腸道并大量繁殖。

從屬水平來說，各組腸道紅球菌屬、羅爾斯通氏菌屬和不動桿菌屬為優(yōu)勢菌群。紅球菌屬可參與工業(yè)合成和轉(zhuǎn)化、生物去污，產(chǎn)生許多生物表面活性劑及生物絮凝劑等，具有較好的生態(tài)價(jià)值，然而，在生物學(xué)上卻常為許多動物的致病菌，如馬紅球菌能夠通過破壞動物呼吸系統(tǒng)，從而引起機(jī)體產(chǎn)生病變[33]。羅爾斯通氏菌屬和不動桿菌屬是致病菌，可分別導(dǎo)致人體產(chǎn)生菌血癥、敗血癥和各種炎癥[34]，并使鱒和印度鯉等水產(chǎn)動物產(chǎn)生潰瘍等病癥[35]。假單胞菌屬為條件致病菌，在環(huán)境良好的作用下，能產(chǎn)生多種抗生素和活性小分子物質(zhì)，具有抗菌溶菌作用，而在不良環(huán)境下會使魚體體表潰爛，體內(nèi)腫脹充血等[36]。乳酸菌屬是水生動物的有益菌，主要是通過分泌乳酸等有機(jī)酸降低pH來抑制革蘭氏致病菌擴(kuò)散，對增強(qiáng)腸道免疫力、改善腸道結(jié)構(gòu)、提高抗病力等具有重要意義[37]。Liu等[20]研究顯示，飼料蛋白質(zhì)水平影響建鯉幼魚腸道乳酸菌的含量，低蛋白質(zhì)組乳酸菌含量顯著低于其他各組，而嗜水氣單胞菌含量顯著高于其他各組。本試驗(yàn)中，低蛋白質(zhì)組乳酸菌含量同樣有所下降，與此同時(shí)，P50組乳酸菌屬含量有所提高，而紅球菌屬和不動桿菌屬含量均有所下降，這反映了該蛋白質(zhì)水平有利于腸道良好微生態(tài)的構(gòu)建。另外，在對畜禽的研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白質(zhì)日糧可有效減少仔豬腸道致病菌的繁殖，并增加乳酸桿菌等益生菌在腸道定植，從而緩解仔豬腸道功能紊亂等問題[38]。而在本試驗(yàn)中，低蛋白質(zhì)組致病菌尚無明顯減少，這可能是由于物種差異所致，石斑魚更傾向于利用蛋白質(zhì)提供能量，對碳水化合物利用能力較弱，而仔豬則能夠更好地利用碳水化合物供能。此外，腸道微生物的組成與眾多因素有關(guān)，其中包括養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖種類、飼料成分和養(yǎng)殖對象的不同生長階段等[39]，因此，多角度評估腸道微生物對宿主生長產(chǎn)生的影響顯得尤為重要。