王詩琪，王雨舟，黃明艷，陳福南

(西南大學 化學化工學院，重慶 北碚 400715)

0 引言

在眾多經典化學發(fā)光反應中，過氧草酸酯化學發(fā)光(PO-CL)以其高量子產率的優(yōu)點引起了廣大研究者們的關注[1]。其中經典的體系由雙(2,4,6-三氯苯基)草酸鹽(TCPO)與過氧化氫組成，在反應過程中會產生一種壽命較長的活性中間體，稱之為二氧雜環(huán)丁二酮(C2O4*)，當其與熒光物質共存時，中間體會將能量轉移給熒光試劑，使化學發(fā)光信號增強[2]。除此之外，咪唑也可以作為TCPO-H2O2化學反應的催化劑，與TCPO形成一種中間產物1,1-草酰二咪唑(ODI)，提高發(fā)光速率，增強發(fā)光強度[3]。在后來的研究中，研究者們通過不同的熒光試劑以提高體系的發(fā)光強度，包括羅丹明6G[4]、紅熒烯[5]、番紅[6]等傳統(tǒng)染料。然而，有機染料具有一定的毒性且不易降解使其應用受限，所以尋找新的熒光物質應用于TCPO-H2O2發(fā)光體系具有重要的意義。

與常規(guī)熒光染料相比，半導體量子點具有寬的吸收帶和可調的窄發(fā)射，并且亮度可改善，具有光穩(wěn)定性[7, 8]。然而，量子點毒性問題依舊是限制其應用于生物領域的關鍵問題。近年來，聚合物納米粒子(PNPs)由于其亮度高、量子產率高，以及低毒、良好的生物兼容性和合成方式多樣等特性，已經廣泛地引起了很大關注[9-11]。PNPs在熒光成像、生物傳感以及材料科學領域已有廣泛應用[12-14]。

本文研究了PNPs在TCPO-H2O2體系中的發(fā)光行為，我們發(fā)現(xiàn)，在過氧化氫存在下，PNPs可以對體系產生增強的發(fā)光信號，對此提出了可能的機理，PNPs作為一種新型熒光納米材料，與中間體二氧雜環(huán)丁二酮(C2O4*)發(fā)生能量共振轉移使信號增強。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

過氧化氫(30%，V/V)、磷酸、丙酮均購自重慶川東化工有限公司；組氨酸、雙(2,4,6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)購自上海源葉生物科技有限公司。1×10-2mol/L TCPO儲備液由TCPO溶解在丙酮中得到，工作溶液通過稀釋儲備液得到，現(xiàn)配現(xiàn)用。實驗用水均為超純水，所有試劑均為分析純。

超微弱化學發(fā)光檢測儀(BPCL，北京建新力拓科技有限公司)，UV-2550紫外可見分光光度計(島津公司，日本)，F(xiàn)-4500熒光分光光度計(日立公司，日本)，BILON超聲波清洗器(上海比朗儀器制造公司)，Talos F200X透射電子顯微鏡(FEI公司，美國)，ESCALAB 250Xi-X射線光電子能譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)，格蘭仕P70D20N1P-G5家用微波爐(格蘭仕集團，廣東)。過程中信號的捕獲和數(shù)據(jù)的采集由Windows XP系統(tǒng)下的BPCL軟件完成。

1.2 聚合物納米粒子(PNPs)的制備

參照文獻[15]，部分操作有改動，合成了水溶性聚合物納米粒子(PNPs)。具體步驟為：2 g組氨酸溶于20 mL H3PO4溶液(0.5 mol/L)，均勻混合后置于微波爐(700 W)中加熱3 min，冷卻至室溫，得到棕黑色固體物質。固體加入30 mL超純水溶解，溶液在12 000 rpm下離心20 min，得到的上清液在超純水中透析48 h進行純化處理。最后的溶液存放于冰箱中4 ℃保存。

1.3 實驗步驟

流動注射化學發(fā)光分析裝置如圖1所示，由兩個恒流泵組成，一臺泵輸送TCPO和PNPs，另一臺在相同流速下進行H2O2溶液和載流的運輸。開啟恒流泵，使PNPs溶液與TCPO在穩(wěn)定流速下在反應盤管內充分混合，待基線平穩(wěn)后，將H2O2溶液和載流與體系混合，化學發(fā)光信號由-750 C的工作電壓下的光電倍增管放大采集，并被BPCL超微弱化學發(fā)光儀記錄。用相對發(fā)光強度ΔI=I-I0對測定目標定量，公式中I與I0分別對應聚合物納米粒子和空白溶液的發(fā)光強度。

圖1 流動注射化學發(fā)光裝置示意圖Fig.1 Diagram of flow injection chemiluminescence system.High voltage:-750 V.The flow rates of P1 and P2 were both 2.0 mL/min

2 結果與討論

2.1 聚合物納米粒子(PNPs)的表征

聚合物納米粒子的透射電鏡(TEM)圖像如圖2A所示。由圖2A可知，聚合物納米粒子近似呈球形，粒徑分布在20～70 nm范圍之間，平均粒徑為44 nm，而且PNPs屬于單分散體系，沒有存在聚集現(xiàn)象。根據(jù)在UV-2550紫外可見分光光度計和F-4500熒光分光光度計測量結果，圖2B所示分別為紫外-可見吸收光譜(黑線)和熒光光譜(紅線)，在紫外波長296 nm處有特征吸收峰，最大熒光發(fā)射波長為410 nm。并對PNPs進行光電能譜(XPS)表征(如圖2C所示)，XPS結果顯示該PNPs中存在C、N、O等3種元素。

圖2 PNPs表征結果TEM(A)；紫外-可見吸收光譜和熒光光譜(B)；XPS(C)Fig.2 Characterization of PNPs.TEM (A); UV-vis spectra and Fluorescence spectra of PNPs (B); X-ray photoelectron spectroscopy (C)

2.2 化學發(fā)光動力學性質

我們進一步探討了PNPs對TCPO-H2O2化學發(fā)光體系的影響結果如圖3所示。當沒有PNPs存在時，TCPO-H2O2化學發(fā)光體系僅呈現(xiàn)出較弱的CL信號(圖3曲線a)；當PNPs存在時，該化學發(fā)光體系的CL信號顯著增強(曲線b)。通過化學發(fā)光動力學性質研究表明，我們所制備的低毒的PNPs能顯著增強TCPO-H2O2化學發(fā)光體系，有望于進一步拓寬其應用范圍。

2.3 反應條件的優(yōu)化

我們進一步優(yōu)化新建立的PNPs-TCPO-H2O2化學發(fā)光體系中各自反應物的濃度以及泵流速。

過氧化氫作為體系的氧化劑，我們考察了H2O2濃度在0.02～0.4 mol/L范圍內對發(fā)光體系化學發(fā)光(CL)信號的影響，結果如圖4A所示。由圖4A可知，當H2O2濃度為0.3 mol/L時，可以檢測到最大CL信號，進一步增大H2O2濃度，CL信號保持不變。考慮到節(jié)約試劑成本的前提下，因此，我們選擇0.3 mol/L的H2O2作為后續(xù)優(yōu)化實驗。

TCPO作為發(fā)光試劑，探究了TCPO在0.5×10-3～1×10-2mol/L范圍內，對體系發(fā)光強度的影響。從圖4B可知，當TCPO在0.5×10-3～1×10-3mol/L范圍內，CL信號隨TCPO濃度增加而提升，當超過1×10-3mol/L時，CL信號強度開始下降。最終，我們選擇1×10-3mol/L為最佳濃度。

圖3 化學發(fā)光動力學曲線TCPO-H2O2體系(a)；TCPO-H2O2-PNPs體系(b)Fig.3 Kinetic curves of CL system.TCPO-H2O2 (a); TCPO-H2O2-PNPs (b)

PNPs在體系中起到關鍵作用，在PNPs-TCPO-H2O2化學發(fā)光體系中起著增敏劑作用。探討了PNPs與H2O的體積比在1∶40～1∶10(V/V)范圍內對CL強度的影響。從圖4C可以看出，CL強度隨比值增大而逐漸增大，因此選擇1∶10為最優(yōu)體積比。隨后對整個體系的流速進行優(yōu)化(圖4D)，當蠕動泵流速從1.0 mL/min到2.2 mL/min，CL強度持續(xù)上升，當達到2.0 mL/min時，信號達到最大，再增大流速，檢測得到的CL信號趨于平穩(wěn)。在此條件下，確定了最佳流速為2.0 mL/min。

圖4 各種條件優(yōu)化對化學發(fā)光信號的影響H2O2濃度(A)；TCPO濃度(B)；PNPs濃度(C)；流速(D)Fig.4 Effects of different optimized conditions on CL intensity. (A) Effect of H2O2 concentration,TCPO 1 mmol/L;VPNPs/VH2O=1∶10;flow rate 2.0 mL/min. (B) Effect of TCPO concentration,H2O2 0.3 mol/L;VPNPs/VH2O=1∶10;flow rate 2.0 mL/min. (C) Effect of PNPs concentration,H2O2 0.3 mol/L;TCPO 1 mmol/L;flow rate 2.0 mL/min. (D) Effect of flow rate,H2O2 0.3 mol/L;TCPO 1 mmol/L;VPNPs/VH2O=1∶10

2.4 機理探討

TCPO-H2O2化學發(fā)光反應機理已有研究[16-18]。過氧草酸酯與過氧化氫反應可以生成一種壽命較長的活性中間體，二氧雜環(huán)丁二酮(C2O4*)，與熒光物質共存時，能迅速分解產生化學發(fā)光。其發(fā)光體被認為是二氧雜環(huán)丁二酮與熒光物質形成的電荷轉移配合物，也可以認為是另一種激發(fā)態(tài)的配合物，此中間體不穩(wěn)定會迅速分解，產生激發(fā)態(tài)的熒光物質和基態(tài)CO2。根據(jù)PNPs-TCPO-H2O2體系的化學發(fā)光光譜圖(圖5)，其最大發(fā)射峰位于480 nm左右，與熒光光譜有部分重疊，我們初步認為可能是發(fā)生了共振能量轉移，二氧雜環(huán)丁二酮把能量轉移給聚合物納米粒子，形成激發(fā)態(tài)的PNPs*，PNPs*回到基態(tài)從而發(fā)光。

圖5 PNPs-TCPO-H2O2體系的熒光光譜(a)與化學發(fā)光光譜(b)Fig.5 Spectrum of PNPs-TCPO-H2O2 system.Fluorescence spectrum (a) and CL spectrum (b)

為了驗證上述我們的初步猜想，已有文獻報道可通過改變反應試劑混合順序探究其機理[2]。為此我們改變了反應試劑的混合順序，探究其對發(fā)光強度的影響。與H2O2-TCPO體系的動力學(圖2b)相比，通過將H2O2注入PNPs與TCPO混合溶液得到了最高的信號(見圖6a)，其原因是混合前并未發(fā)生化學反應。而當把TCPO注入PNPs與H2O2混合溶液時，CL強度略有下降(見圖6b)，說明PNPs與H2O2的反應產物有部分參與了整個體系的CL發(fā)射。將TCPO與H2O2混合，得到的信號最低(見圖6c)，是中間產物(C2O4*)的快速形成與解離造成的。

圖6 不同混合順序的CL動力學曲線H2O2注入PNPs與TCPO的混合溶液(a)；TCPO注入H2O2與PNPs的混合溶液(b)；PNPs注入H2O2與TCPO的混合溶液(c)Fig.6 CL kinetics curve of different mixing sequence.H2O2 injected with TCPO and PNPs mixed solution (a); TCPO injected with H2O2 and PNPs mixed solution (b); PNPs injected with H2O2 and TCPO mixed solution (c)

3 結論

綜上所述，本文合成了一種綠色低毒的聚合物納米粒子(PNPs)，通過對TCPO、H2O2、PNPs濃度以及流速的優(yōu)化，有效提高了TCPO-H2O2體系的化學發(fā)光信號，并對其可能的機理進行了探討，建立了一種新的過氧草酸酯類的PNPs-TCPO-H2O2化學發(fā)光新體系，為進一步拓展PNPs-TCPO-H2O2新型化學發(fā)光體系應用于環(huán)境、生物、材料、藥物、食品等領域的分析提供了潛在思路。