龔小見(jiàn)，趙 超，周 欣*

(1.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州師范大學(xué)貴州省藥物質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550001)

0 引言

黔產(chǎn)馬蘭草(KalimerisindicaL.)為菊科馬蘭屬植物的帶根全草。別名魚(yú)鰍串、雞兒腸、田邊菊、蓑衣草、路邊菊等，在全國(guó)各地均有分布，在貴州資源豐富[1]。黔產(chǎn)馬蘭草含有多種維生素、礦物質(zhì)和氨基酸，營(yíng)養(yǎng)豐富可作為蔬菜食用，兼有多種藥理功效，是集食、藥用價(jià)值于一身，備受青睞的時(shí)令野菜珍品[2-3]。黔產(chǎn)馬蘭草全草可入藥，具有清熱利濕，理氣消食，解毒消腫等功效。用于治療胃脘脹痛，感冒咳嗽，水腫，淋濁等癥[4]。

黔產(chǎn)馬蘭草在貴州民間作為特色藥材廣泛使用，且目前有多家藥廠以黔產(chǎn)馬蘭草藥材做為原料生產(chǎn)中成藥(如馬蘭感寒膠囊、感清糖漿等)。雖然黔產(chǎn)馬蘭草已被收錄于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)中，但在該標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，不能有效控制藥材質(zhì)量，在一定程度上限制了黔產(chǎn)馬蘭草的更廣泛應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黔產(chǎn)馬蘭草中的化學(xué)成分為三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)和甾體類(lèi)化合物[5-18]。我們?cè)趯?duì)馬蘭的前期化學(xué)成分分研究中發(fā)現(xiàn)黔產(chǎn)馬蘭草藥材中的大部分化合物為三萜類(lèi)化合物，因此本次以黔產(chǎn)馬蘭草中總皂苷為研究對(duì)象，參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)采用紫外分光度法建立黔產(chǎn)馬蘭草中總皂苷含量測(cè)定方法，為更好地控制黔產(chǎn)馬蘭草藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

本次實(shí)驗(yàn)建立采用紫外分光光度法建立了黔產(chǎn)馬蘭草中總皂苷的含量測(cè)定方法，對(duì)10批貴州不同產(chǎn)地馬蘭草中的總皂苷進(jìn)行了含量測(cè)定，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好，回收率可靠，可用于黔產(chǎn)馬蘭草藥材的質(zhì)量控制方法。

1 材料與儀器

1.1 藥材和試劑

馬蘭草藥材均采自貴州不同地區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為馬蘭草(KalimerisindicaL.)，樣品采集信息如表1所示。

表1 馬蘭草藥材信息表Tab.1 Tested material of Kalimeris indica and their local variety

齊墩果酸對(duì)照品(純度大于98%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；石油醚(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；香草醛(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸(分析純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸(分析純)，天津政成化學(xué)制品有限公司；水為蒸餾水。

1.2 儀器和設(shè)備

200 g搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；SPECTRA max PLUS 384光吸收酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司Molecular Devices)；AL 204萬(wàn)分之一分析天平和XS 105十萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；TDL-5A低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(常州市萬(wàn)合儀器制造有限公司)；HWS-28電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取0.005 9 g已干燥恒重的齊墩果酸于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，定容，搖勻，即得0.59 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。置于4 ℃冰箱中保存。

2.2 供試樣品溶液制備

精密稱(chēng)取各產(chǎn)地的馬蘭樣品0.200 0 g(精確到0.000 1 g)，加10 mL石油醚回流30 min，離心(3 500 r/min，5 min)，去掉上清液后，濾渣用10 mL甲醇于回流提取30 min，離心(3 500 r/min，5 min)，取上清液，定容至10.0 mL，待測(cè)。

2.3 檢測(cè)方法及波長(zhǎng)的確定

取一定量的齊墩果酸對(duì)照品溶液10 mL試管中揮干溶劑，依次加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸、0.8 mL高氯酸，于80 ℃水浴加熱20 min，取出冰水浴20 min，加入5.0 mL冰醋酸，用紫外分光光度計(jì)，在400～700 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描(見(jiàn)圖1)，結(jié)果在550 nm處有特征性吸收峰，故選擇550 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 對(duì)照品齊墩果酸的紫外吸收Fig.1 UV absorption of oleanolic acid

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于10 mL試管中，揮干溶劑，分別加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，置于80 ℃水浴中熱水浴20 min，取出后冰水浴20 min，加入5.0 mL冰醋酸，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)量吸光度值，同時(shí)以試劑為空白對(duì)照。以吸光度為縱坐標(biāo)A，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)c，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程A=9.787 5c-0.030 6(r=0.999 8)，表明齊墩果酸在0.029～0.079 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of oleanolic acid

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取0.200 0 g馬蘭草藥材(精確到0.000 1 g)，按2.2項(xiàng)下制備供試品，取0.5 mL供試品按2.3項(xiàng)方法測(cè)定，在550 nm波長(zhǎng)處每隔5 min測(cè)定一次吸光度值，測(cè)定6次。所測(cè)吸光度值的RSD為0.90%，說(shuō)明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取0.200 0 g馬蘭草藥材(精確到0.000 1 g)，按2.2項(xiàng)下制備供試品，取0.5 mL供試品按2.3項(xiàng)方法測(cè)定，在550 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定吸光度，在30 min內(nèi)平行測(cè)6份，RSD值為0.45%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取0.200 0 g(精確到0.000 1 g)馬蘭草藥材6份，按2.2項(xiàng)下制備供試品，取0.5 mL供試品按2.3項(xiàng)方法測(cè)定，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD值為0.77%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精確稱(chēng)取馬蘭草樣品9份，每份0.100 0 g(精確到0.000 1 g)，按80%、100%、120%加標(biāo)準(zhǔn)品，按2.2項(xiàng)下制備供試品，取0.5 mL供試品按2.3項(xiàng)方法測(cè)定，各平行3份顯色檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，平均加樣回收率為96.46%，RSD值為1.04%，結(jié)果表明回收率良好。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)Tab.2 Add recovery experiment

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取各產(chǎn)地的馬蘭樣品0.200 0 g(精確到0.000 1 g)，按2.2項(xiàng)下制備供試品，取0.5 mL供試品按2.3項(xiàng)方法測(cè)定，在550 nm處測(cè)定波長(zhǎng)，計(jì)算含量。結(jié)果如表3所示，對(duì)10批次黔產(chǎn)地馬蘭草樣品中總皂苷的含量測(cè)定，含量結(jié)果在1.86%～3.12%之間，說(shuō)明黔產(chǎn)馬蘭草藥材在總皂苷含量方面質(zhì)量穩(wěn)定均一。

表3 黔產(chǎn)地馬蘭總皂苷的含量Tab.3 Total Saponins of Kalimeris indica from different producing areas

3 討論

3.1 顯色方法的考查

實(shí)驗(yàn)對(duì)顯色方法中的香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、顯色溫度和顯色時(shí)間進(jìn)行了考查，結(jié)果表明，冰醋酸用量為0.2 mL、高氯酸用量為0.8 mL、顯色溫度為80 ℃和顯色時(shí)間為25 min時(shí)吸光度值最高。

3.2 藥材提取方法的考查

分別對(duì)提取方式、提取溶劑、料液比、提取時(shí)間以及藥材粒度進(jìn)行了考查，結(jié)果表明，提取方式為回流提取、提取溶劑為純甲醇、溶劑用量為1∶50、提取時(shí)間為30 min和藥材粒度為40目時(shí)，藥材中的總皂苷含量最高。

3.3 藥材含量測(cè)定結(jié)果討論

本實(shí)驗(yàn)建立了黔產(chǎn)馬蘭草中總皂苷的含量測(cè)定方法，通過(guò)方法學(xué)考察，該方法精密度和重復(fù)性好、回收率高，且穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)單實(shí)用，可用于黔產(chǎn)馬蘭草藥材總皂苷含量測(cè)定。采用所建立的含量測(cè)定方法對(duì)采自貴州10個(gè)不同產(chǎn)地的馬蘭草藥材進(jìn)行了皂苷含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10個(gè)不同產(chǎn)地的馬蘭草藥材中總皂苷含量均在在1.86%～3.12%之間，說(shuō)明黔產(chǎn)馬蘭草藥材在總皂苷含量方面質(zhì)量穩(wěn)定均一。