溫永琴， 徐詠強， 何建芳， 黃會杰， 朱瑩， 周嬋， 張麗君

東莞市人民醫(yī)院病理科(廣東東莞 523059)

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)基因1(RB1)是腫瘤抑制基因。RB1是第1個被克隆的腫瘤抑制基因，RB1對人類視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用[1]。既往研究[2]表明，RB1基因在乳腺癌患者中經(jīng)常發(fā)生突變，特別是在三陰性乳腺癌中。Rb蛋白主要作為轉錄輔因子起作用，它能結合激活E2Fs，E2F1/2/3a的反式激活結構域，并募集染色質修飾因子如組蛋白脫乙酰酶和甲基化酶以沉默基因表達[3]。Rb蛋白也結合多種其他細胞蛋白[4],但它主要通過激活E2F的調(diào)節(jié)發(fā)揮其對細胞增殖和存活的抑制作用。既往研究[5]顯示Rb基因缺失可導致細胞增殖的失調(diào)從而促進了癌癥的生長，且在大多數(shù)類型的癌癥中，Rb蛋白的失活伴隨著諸如p53的失活從而促進腫瘤存活途徑的誘導。同時，RB1基因的缺失直接影響了腫瘤患者的藥物使用，既往對于RB1基因的研究主要集中在肺癌、卵巢癌以及膀胱癌[6]，但RB1基因表達及蛋白的表達水平在乳腺癌中的作用仍未明確。因此，進一步明確RB1基因及其蛋白在乳腺癌中的表達水平對臨床特征及預后的影響，對乳腺癌的防治具有重要意義。本研究旨在探討乳腺癌患者組織中RB1基因及蛋白表達與臨床特征的關系，并分析RB1基因表達與突變對臨床預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2017年6月于我院行手術治療的乳腺癌患者共250例，取其保存的病理石蠟切片進行檢查，納入標準：(1)經(jīng)病理確診為乳腺癌；(2)術前未行新輔助放化療；(3)所有患者獲得完整隨訪。排除病歷資料不完整或失訪的患者，以及合并機體免疫性疾病或長期使用激素治療的患者。所有標本均取其癌組織和癌旁組織進行后續(xù)研究，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核并批準。250例乳腺癌患者，年齡35～71歲，平均(54.6±7.3)歲。記錄所有患者的基本臨床資料，包括腫瘤大小、組織分級、淋巴結轉移、表皮生長因子受體2(HER2)、雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)以及TNM分期。

1.2 免疫組化檢測 將石蠟包埋的乳腺癌組織和癌旁正常組織以5 μm厚度進行組織切片。將組織切片進行脫蠟水化后，采用檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原修復，應用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。采用山羊血清進行封閉后，采用兔Anti-RB-1抗體(ab224426,Abcam)以1∶100稀釋后，在4℃條件下進行一抗孵育過夜，隨后在室溫條件下與HRP標記的山羊二抗孵育。最后采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為底物進行變色反應，然后蘇木精復染并封片。所有切片RB1的表達水平由2位有經(jīng)驗的病理師在隨機選擇5個高倍鏡視野(200×)進行評估，具體的評估方法為：染色強度(0為未染色; 1為弱染; 2為中等染; 3為強染)，同時記錄陽性表達RB1的范圍(計分為0：<5%; 1：5%～25%; 2：26%～50%; 3：51%～75%; 4：76%～100%)。將RB1的染色強度計分和陽性表達范相乘以獲得復合表達分數(shù)(composite expression score，CES)[7]，將得到RB1的表達水平的CES，將患者分為兩組，RB1低表達(CES <6)和高表達組(CES≥6)。

1.3 RB1表達的生物信息學分析 采用Kaplan-Meier Plotter工具(http://kmplot.com/analysis/)分析RB1基因與乳腺癌患者臨床預后的關系。采用cBioPortal工具(http://www.cbioportal.org/)分析RB1基因在乳腺癌病例集中的突變水平，并分析乳腺癌患者RB1基因突變與非突變患者臨床預后的關系。

2 結果

2.1 RB1在乳腺癌和癌旁組織的表達水平對比 250例患者的乳腺癌和癌旁組織中，其中乳腺癌組織的RB1表達水平的CES得分平均為4.8±1.6，而癌旁組織為5.2±2.1，其中乳腺癌組織的RB1表達水平顯著低于正常癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，不同表達RB1水平的癌組織和癌旁組織見圖1。

2.2 乳腺癌RB1表達水平與乳腺癌臨床特征的關系 其中RB1表達水平與乳腺癌的年齡、組織分級、HER2、ER和PR的陽性比例均沒有顯著的相關性(P>0.05)，而RB1低表達的患者其腫瘤最大徑≥3 cm、淋巴結轉移以及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者比例均顯著高于RB1高表達的患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3 乳腺癌組織中RB1表達水平與臨床預后的關系 250例乳腺癌患者隨訪時間為6～47個月，中位隨訪時間為33個月， 其中RB1高表達的患者其總體生存率顯著高于RB1低表達的患者，差異有統(tǒng)計學意義(HR=0.56，95%CI：0.32～0.97，P=0.036)。見圖2～3。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織的不同RB1表達水平(免疫組化，×200)

2.4 RB1表達與乳腺癌臨床預后的多元Cox回歸分析 Cox 多因素模型分析結果顯示乳腺癌患者的TNM分期及RB1表達水平顯著影響患者的臨床預后(P<0.05)，見表2。

3 討論

乳腺癌是一種異質性疾病，其中不同的病理學和基因表現(xiàn)影響患者的臨床預后和治療方案。通常，ER和PR或HER2擴增狀態(tài)的存在直接影響了治療的過程[8]。由于乳腺癌中復雜的分子機制，既往研究[9]表明，RB1和Tp53是腫瘤的重要抑癌基因，也參與了乳腺癌在內(nèi)的許多人類癌癥的發(fā)生和進展。同時，有研究[10]顯示RB1和Tp53在28%～40%的三陰性乳腺癌患者中一起存在失活狀態(tài)，且通常由純合缺失引起的RB基因缺失主要發(fā)生在三陰性乳腺癌中。然而，在內(nèi)分泌治療后的促轉移性腫瘤微環(huán)境中，RB1表達損失更加明顯。既往研究[11]顯示RB也可以通過由含有CDK4/6的復合物引發(fā)的磷酸化而失活。在乳腺癌中，異常的CDK4/6活性可解除對RB磷酸化的正?？刂疲钚约毎芷诘鞍?CDK復合物對Rb(pRb)的磷酸化導致E2F家族轉錄因子的釋放，以及S期進入所需基因的轉錄。CDK4/6作為治療靶標的重要性現(xiàn)已在ER/PR陽性乳腺癌中得到充分證實。但即使這些藥物有效，仍難以阻礙疾病的臨床進展，這可能與RB1基因表達損失的有關。由于RB1基因與乳腺癌存在密切的關系，但目前對于RB1基因、蛋白表達水平以及其突變對于乳腺癌患者臨床預后的影響仍未明確。本研究擬通過臨床樣本以及生物信息學初步明確了RB1基因和蛋白高表達是乳腺癌預后良好的標記物，但RB1基因突變的乳腺癌患者預后不良。RB1基因表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移以及TNM分期密切相關，表明了抑癌基因RB1基因發(fā)生突變是影響乳腺癌預后不良的重要風險因素。

表1 乳腺癌組織中RB1表達水平與臨床特征的關系 例(%)

腫瘤抑制基因RB1基因調(diào)節(jié)細胞周期導致細胞分裂的過程，并且CDK4和CDK6酶阻斷RB1活性，這可導致不受控制的細胞增殖和生長[12]。因此，本研究結果顯示，RB1蛋白在乳腺癌中的表達水平顯著下降，且RB1蛋白在乳腺癌中的表達水平與腫瘤大小和淋巴結轉移密切相關，本研究結果與既往研究[13]結果表明RB1基因在腫瘤細胞周期調(diào)控的重要作用相一致。雖然乳腺癌的CDK 4/6抑制劑可以抑制腫瘤的增殖，但容易在治療反應數(shù)月后出現(xiàn)耐藥性。有研究[14]表明，RB1基因的突變導致RB1基因功能喪失并因此導致促進了腫瘤對CDK4/6抑制劑的抗性。本研究中采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的結果顯示了雖然RB1基因高表達其乳腺癌患者預后更優(yōu)，但進一步分析RB1基因突變的患者其預后顯著差于非突變的患者，表明了RB1基因突變嚴重影響了RB1基因的抑癌功能。

注：A：不同RB1表達水平對乳腺癌總體存活率的影響(n=1 420)；B：不同RB1表達水平對乳腺癌無復發(fā)生存率的影響(n=3 951)；C：RB1突變與非突變對患者的總體存活率的影響(n=1 918)

圖2乳腺癌RB1基因表達及突變對臨床預后的影響

圖3 乳腺癌RB1表達水平與臨床預后的關系

表2 乳腺癌患者Cox多因素生存分析

本研究結果也進一步顯示，乳腺癌組織樣本中，RB1高表達患者的總體生存率更優(yōu)。既往有研究[15]表明RB1基因富集的卵巢癌患者其預后更好，聯(lián)合PD0332991 與卡鉑或紫杉醇共同治療時能顯著提高RB1基因富集卵巢癌患者的臨床療效。同時，在肺癌中，抑制RB1后可導致p16 表達上調(diào)，p16 保護RB1 缺乏的細胞免受DNA損傷，也導致了基因的不穩(wěn)定，增加了細胞的增殖功能[16]。RB1 的表達水平也是膀胱癌患者膀胱灌注化療治療效果以及腫瘤復發(fā)的預測因子[17]。而本研究結果也顯示RB1高表達水平是乳腺癌患者預后良好的重要因素。雖然本研究對納入的樣本進行了蛋白水平的評估，但本研究并未對所納入的標本進行RB1基因突變檢測，對于RB1基因突變其對蛋白功能的影響以及對乳腺癌患者預后的影響仍需要進一步加大樣本量進行評估。

綜上所述，乳腺癌RB1表達水平與腫瘤的大小、淋巴結轉移及臨床預后密切相關，RB1基因高表達顯著改善乳腺癌患者的臨床預后，合并RB1基因突變的乳腺癌患者預后較差。