邢飛, 周瑾△, 姜玉新, 金躍

1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院檢驗(yàn)科(江蘇淮安 223000)； 2皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室(安徽蕪湖 241002)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，臨床受累可影響人體多個(gè)器官或系統(tǒng)，尤其是骨骼肌、腎臟、心臟、皮膚和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)[1-2]。SLE好發(fā)于女性，男女比例為1∶10[3]。SLE具有復(fù)雜而強(qiáng)大的遺傳基礎(chǔ)，分子遺傳學(xué)在研究人類和動(dòng)物時(shí)確定了SLE發(fā)病機(jī)制的重要基因。與患病密切相關(guān)的基因是人類白細(xì)胞抗原(HLA)等位基因，如DR3、DR4，其次是非HLA樣蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型(PTPN22)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)和干擾素調(diào)節(jié)因子5。在非HLA基因中，PTPN22被認(rèn)為是自身免疫性疾病中最有效的基因[4-5]。近些年國外研究提示該基因多態(tài)性與1型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和SLE等自身免疫疾病發(fā)生有關(guān)，且存在種族差異[6-7]。本研究主要探討蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(PTPN22)基因rs1310182、rs2488457、 rs33996649位點(diǎn)多態(tài)性是否與江蘇淮安地區(qū)漢族人群SLE遺傳易感性有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 231例SLE患者均來自2018年1月至2019年6月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院門診和住院患者，為淮安市常住(≥10年)人口，年齡13～75歲，平均(41.91±13.74)歲。所有患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)院 1997年修訂的 SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)；正常對照組 202例，均為我院體檢中心各項(xiàng)指標(biāo)正常的人群，年齡13～73歲，平均(35.48±11.27)歲。一般特征見表1。以上所有研究對象均簽有知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集及DNA提取 采集受檢者外周靜脈血2 mL，用人類基因組提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因組DNA，限制性內(nèi)切酶、引物(根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物)見表2，以上均由上海生工股份有限公司負(fù)責(zé)合成。

表1 兩組人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征 例

表2 PTPN22基因引物序列

1.2.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系50 μL；模版3 μL，引物1 μL，dNTP 1 μL，10×Buffer 5 μL，Tap酶0.5 μL，雙蒸水34.5 μL，MgCI24 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 延伸 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳25 min，在SyngeneG：BOX熒光凝膠成像系統(tǒng)下分析。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢測 病例組和對照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測顯示樣本均符合Hardy-Weinberg遺傳規(guī)律(表3)，說明本研究樣本可進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 基因型頻率和等位基因頻率比較 對rs1310182、rs2488457、 rs33996649位點(diǎn)基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較顯示， rs1310182基因位點(diǎn)CT、TT型及CT+TT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，OR值(95%CI)分別為0.757(0.462～1.240)、1.192(0.690～2.059)及0.894(0.260～1.425)。等位基因T亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR值(95%CI)為1.124(0.860～1.470)；對rs2488457位點(diǎn)基因型、等位基因頻率進(jìn)行比較，CC、GC+CC型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OR值(95%CI)為2.921(1.534～5.562)、2.145(1.160～3.967)，等位基因C亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR值(95%CI)為1.859(1.389～2.487)；rs33996649基因位點(diǎn)GA、AA型及GA+AA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，OR值(95%CI)分別0.837(0.417～1.682)、0.511(0.253～1.031)、0.861(0.338～1.292)，而等位基因A有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR值(95%CI)為0.692(0.519～0.922)。見表4～5。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果 例

表4 PTPN22各基因位點(diǎn)不同基因型對SLE相對危險(xiǎn)度 例

表5 PTPN22各基因位點(diǎn)等位基因頻率分布 例

3 討論

PTPN22位于1號染色體短臂(lp13.3-13.1)，包含16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，編碼淋巴特異性蛋白酪氨酸磷酸酶(LYP)，屬于酪氨酸磷酸酶家族(PTPs)。LYP是造血細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸酶，主要表達(dá)在成熟或未成熟的T、B淋巴細(xì)胞，抑制上述細(xì)胞對抗原的免疫應(yīng)答[8]，最近，研究表明[9]LYP蛋白是幾種自身免疫性疾病的重要遺傳基因座，包括SLE。該蛋白通過與多種銜接分子結(jié)合而影響T細(xì)胞活化，包括c-src酪氨酸激酶(Csk)、Grb2和c-Cbl[10]。該基因已被鑒定為各種自身免疫性疾病易感基因，如格雷夫斯病、類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)[6-7,11]。

在國外，Taniyama等[12]于2010年對日本人群進(jìn)行了一項(xiàng)研究，證明rs1310182與T1D患者呈正相關(guān)。那些不含rs1310182風(fēng)險(xiǎn)等位基因的人受到保護(hù)。而對于PTPN22基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)系，近年來，國內(nèi)外主要是針對1858C/T位點(diǎn)研究較多，Kyogoku等[7]發(fā)現(xiàn)PTPN22SNP與SLE之間呈劑量依賴效應(yīng)，在北美SLE患者中純合子T/T的相對危險(xiǎn)度是雜合子T/C的2倍[OR=4.37，95%CI(1.98～9.65)]，后者危險(xiǎn)度較之純合子C/C也有所增高[OR=1.37，95%CI(1.07～1.75)]。有學(xué)者[13]分別對家族性及散發(fā)的SLE患者研究發(fā)現(xiàn)，PTPN22 單核苷酸多態(tài)性在家族性SLE中比散發(fā)的SLE者更有意義，故可作為遺傳標(biāo)志在SLE中發(fā)揮重要作用，這說明PTPN22基因可作為自身免疫性疾病的一個(gè)易感基因。Bahrami等[14]認(rèn)為PTPN22 rs1310182 A等位基因和rs1310182 AA基因型與兒童SLE可能有關(guān)。Ferreira等[15]研究發(fā)現(xiàn)SLE患者PTPN22等位基因(rs2476601C>T)對Treg頻率的影響。Al-Awadhi等[16]研究報(bào)道PTPN22基因功能變體R620W的頻率與其他世界人群相比最高的。與健康對照相比，這種變異在SLE患者中的患病率較高，表明其在賦予SLE易感性。de Lima等[17]研究發(fā)現(xiàn)PTPN221858 C>T多態(tài)性的T等位基因和T/T基因型賦予SLE易感性，特別是在白種人和拉丁裔人群中，提示PTPN221858 C>T是SLE易感性的潛在遺傳標(biāo)記。在國內(nèi)程艷麗等[18]研究發(fā)現(xiàn)PTPN22基因的2個(gè)位點(diǎn)-1858C/T和-1123G/C與湖北地區(qū)漢族人群 SLE的發(fā)病無相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，PTPN22基因位點(diǎn)rs2488457(-1123G/C)基因型CC/GC+GG、等位基因C均與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這點(diǎn)與馮雪等[19]研究結(jié)果一致，說明位點(diǎn)rs2488457與淮安漢族人群SLE發(fā)病可能相關(guān)。同時(shí)我們研究還證實(shí)rs33996649位點(diǎn)基因型多態(tài)性與漢族人群SLE發(fā)生并無相關(guān)性，而其A等位基因與淮安地區(qū)漢族人群SLE發(fā)生可能有關(guān)。而在國外，López-Cano等[20]研究發(fā)現(xiàn)其位點(diǎn)多態(tài)性與墨西哥人SLE發(fā)生有相關(guān)性。López-Mejías等[21]研究PTPN22基因多態(tài)性與過敏性紫癜相關(guān)性可能時(shí)發(fā)現(xiàn)其rs33996649位點(diǎn)并與此疾病無關(guān)聯(lián)。而國內(nèi)Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)PTPN22基因rs33996649的A等位基因與增加甲狀旁腺功能亢進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。肖海等[23]研究發(fā)現(xiàn)PTPN22基rs33996649多態(tài)性與河南漢族肺結(jié)核發(fā)生無關(guān)；rs2488457的G/G基因型與河南漢族肺結(jié)核易感性有一定關(guān)系。李倩等[24]證實(shí)了在云南人群中PADI4基因的rs2240340多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性存在相關(guān)性。Shi等[25]在薈萃分析中發(fā)現(xiàn)PTPN22基因的1858C/T多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性相關(guān)，但要確定因果關(guān)系，需要從中國人口中抽取大量樣本進(jìn)行前瞻性研究。

本試驗(yàn)通過對PTPN22基因位點(diǎn)rs1310182、rs2488457、 rs33996649多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，PTPN22基因位點(diǎn)rs2488457(-1123G/C)基因型CC/GC+GG、等位基因C均與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明位點(diǎn)rs2488457與淮安漢族人群SLE發(fā)病可能相關(guān)。rs33996649位點(diǎn)A等位基因與淮安地區(qū)漢族人群SLE發(fā)生可能有關(guān)。而rs1310182位點(diǎn)和等位基因多態(tài)性，rs33996649位點(diǎn)基因型多態(tài)性與淮安漢族人群SLE發(fā)生并無相關(guān)性。

本研究同樣存在一定不足：(1)選取標(biāo)本量有限可能存在一定誤差；(2)目前研究基因多態(tài)性方法學(xué)較多不能盡可能全部選用。

綜上所述，不同地區(qū)，不同種族其單核苷酸多態(tài)性與同一疾病相關(guān)性存在差異，分析原因可能有：(1)地域的差異；(2)種族的不同；(3)遺傳因素的不同等。今后可能選取更大樣本量，多種族，多人群開展研究，更加詳細(xì)的闡明基因多態(tài)性與SLE發(fā)生、發(fā)展過程。