張 莉，張小蒙

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城 224005）

0 引言

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌［1］，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌［2］，嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，多數(shù)菌株對氟哌酸、菌必治敏感，嗜水氣單胞菌表現(xiàn)多種抗性［3］，其中一個主要原因是含有多種質(zhì)粒［4］。本實(shí)驗(yàn)室從嗜水氣單胞菌中分離得到一種質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBK760，該質(zhì)粒具有多種位點(diǎn)和抗性，具有良好的載體特征。

pMD20是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體［5］。該載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在其多克隆位點(diǎn)處的Xba I和BamH I位點(diǎn)之間增加了Spe I，Nde I，EcoRV3種酶切位點(diǎn)，經(jīng)EcoR V酶切后再在兩側(cè)的3’端添加“T”制備而成［6］。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3’端添加一個“A”的特性，可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率［7］。

雖然質(zhì)粒pBK760和pMD20均可單獨(dú)作為載體來使用，但是如果可以將其優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，就可以發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢，本實(shí)驗(yàn)就結(jié)合質(zhì)粒pBK760和pMD20兩方面的優(yōu)點(diǎn)，利用現(xiàn)代技術(shù)構(gòu)建了一種全新的穿梭質(zhì)粒載體（pBKPU01），便于開展相關(guān)基因功能研究和遺傳育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和載體

質(zhì)粒pBK760由本實(shí)驗(yàn)室從嗜水氣單胞菌中分離并保存，pMD20購自大連寶生物。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購自大連寶生物；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工；其他常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)質(zhì)粒pBK760序列，采用Oligo 6.0軟件設(shè)計1對特異性引物P1、P2，上游引物P1序列為：ATCGTCGACCCTCTAGATGCAG，下游引物P2序列為：CTGACTCTAGCAGGTCGAGGAT。引物由上海生工合成。

1.3 質(zhì)粒pBK760的提取

挑取嗜水氣單胞菌單菌落，接種于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。菌液用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒pBK760，-20℃儲存待用。

1.4 質(zhì)粒pBK760線性化

以質(zhì)粒pBK760為模板，通過設(shè)定引物（P1和P2）進(jìn)行PCR，使環(huán)狀質(zhì)粒pBK760線性化，PCR的具體反應(yīng)條件如表1所示。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 4.5 min，32循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將檢驗(yàn)正確的片段純化回收。

1.5 質(zhì)粒pBK760和載體pMD20的連接

將線性化質(zhì)粒pBK760和載體pMD20進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如表2所示。

操作步驟如下：16℃連接過夜，取2.5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50μL E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100μL菌液涂布含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)入5 mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，獲得穿梭質(zhì)粒載體pBKPU01。

表1 質(zhì)粒p BK760線性化PCR反應(yīng)具體條件

表2 質(zhì)粒p BK760和載體p MD20連接體系

1.6 轉(zhuǎn)化、酶切驗(yàn)證和分析

制備嗜水氣單胞菌感受態(tài)細(xì)胞，用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞［8］，用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，通過HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果證明的確是質(zhì)粒pBKPU01，說明構(gòu)建的穿梭載體pBKPU01能夠在嗜水氣單胞菌中復(fù)制表達(dá)。確定重組質(zhì)粒后進(jìn)行測序分析（華大基因），序列分析結(jié)果和質(zhì)粒pBK760序列相同，驗(yàn)證正確。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以P1、P2為引物，以質(zhì)粒pBK760為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，成功擴(kuò)增出長度為3 817 bp的質(zhì)粒pBK760，與預(yù)期結(jié)果一致，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 pBKPU01單、雙酶切鑒定

對轉(zhuǎn)化并提取的質(zhì)粒pBKPU01通過HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證，酶切后均得到6 000 bp左右的片段，其他片段過小未能顯示，與預(yù)期結(jié)果一致，凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

2.3 pBKPU01圖譜構(gòu)建

以DNAMAN為工具［9］，構(gòu)建pBKPU01圖譜，圖譜如圖3所示。該穿梭質(zhì)粒載體包括位于3 355～3 561的啟動子位點(diǎn)、位于3 726～3 812的信號肽編碼基因、位于1 592～2 363的卡那霉素抗性基因、位于2531～2735的博來霉素抗性基因，位于347～676的lacZ基因以及位于1 833～2 693的氨芐青霉素抗性基因。

3 討論

圖1 質(zhì)粒p BK760經(jīng)PCR線性化后的凝膠電泳

圖2 轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后提取的穿梭質(zhì)粒載體p BKPU01單、雙酶切鑒定電泳

圖3 穿梭質(zhì)粒載體p BKPU01圖譜

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌，嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，多數(shù)菌株對氟哌酸、菌必治敏感，嗜水氣單胞菌表現(xiàn)多種抗性，其中一個主要原因是含有多種質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室從嗜水氣單胞菌中分離得到一種質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBK760，該質(zhì)粒具有多種位點(diǎn)和抗性，具有良好的載體特征。

pMD20是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體。該載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在其多克隆位點(diǎn)處的Xba I和 BamH I位點(diǎn)之間增加了 Spe I，Nde I，EcoR V3種酶切位點(diǎn)，經(jīng)EcoR V酶切后再在兩側(cè)的3’端添加“T”制備而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3’端添加一個“A”的特性，可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率［10-13］。

雖然質(zhì)粒pBK760和pMD20均可單獨(dú)作為載體來使用，但是如果可以將其優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，就可以發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢，本研究就結(jié)合質(zhì)粒pBK760和pMD20兩方面的優(yōu)點(diǎn)，利用現(xiàn)代技術(shù)構(gòu)建了一種全新的穿梭質(zhì)粒載體（pBKPU01），便于開展相關(guān)基因功能研究和遺傳育種工作。