王雯智 鄭蕾 李虹

宮頸癌(cervical cancer)是危及女性生命的惡性腫瘤之一，主要與HPV感染、不良生活習慣等有關(guān)，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快，宮頸癌的發(fā)病率及死亡率逐年增加[1]。目前，主要以手術(shù)與放療為主要治療手段，放療敏感者不良預(yù)后因素明顯減少，但放療不敏感者預(yù)后較差，因而放療前預(yù)測患者對放療的敏感性具有重要臨床指導價值[2]。miRNAs在腫瘤發(fā)展進程中發(fā)揮致癌或抑癌作用，研究表明miRNAs表達可影響抗癌藥物的敏感性，且miRNAs表達變化與放療敏感性的關(guān)系密切相關(guān)，可作為個性化治療的生物性標志[3]。研究表明miR-15家族中miR-15a可調(diào)控靶基因DCLK1(doublecortin-like kinase 1，DCLK1)表達參與腫瘤發(fā)生過程并能改變腫瘤細胞對化療的敏感性，而miR-15b作為miR-15家族的一員是否可通過調(diào)控靶基因DCLK1表達變化影響患者對放療敏感性值得進行研究[4]。因此，本研究主要探討宮頸癌中miR-15b、DCLK1表達變化與放療敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2015年9月于陜西省人民醫(yī)院治療的118例宮頸癌患者為研究對象，并將手術(shù)中切除的癌組織標本為宮頸癌組，并選取相應(yīng)癌旁5 cm處的正常組織標本為正常組?；颊吣挲g38～72歲，平均年齡(54.42±6.13)歲；收集臨床資料包括病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及肌層浸潤程度。病理分級[5]：高分化20例，中/低分化共98例。按照國際FIGO分期標準進行臨床分期[6]：Ⅰ期 52例，Ⅱ期48例，Ⅲ期18例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例。本研究經(jīng)過陜西省人民醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①宮頸癌患者均經(jīng)病理證實；②無放療禁忌證；③確診前未接受放療或化療；④生存時間>3個月；⑤所有患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①嚴重心腦血管合并癥；②肝腎功能異常；③患有其他腫瘤；④臨床資料不全者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：入組時宮頸癌組織及癌旁組織標本均來源于手術(shù)切除，放療后采用活檢鉗采集宮頸癌病灶處及癌旁組織(大小為4～5 mm)，錫紙包好后將其置于液氮中保存，稍后將其置于-80℃超低溫冰箱保存待測。

1.3.2 qRT-PCR法檢測宮頸組織中miR-15b、DCLK1表達量：采用RNA試劑盒提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為qRT-PCR反應(yīng)體系20 μl：cDNA 1 μl，引物各0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl，RNase-free ddH2O 8 μl。miR-15b以U6內(nèi)參基因，DCLK1以β-actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)程序為95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃ 15 s，72℃ 15 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后將數(shù)據(jù)保存并對所得數(shù)據(jù)Ct值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-15b與DCLK1 mRNA相對表達量，并分析miR-15b與DCLK1表達與患者臨床病理特征的關(guān)系。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組織化學法檢測宮頸癌組織中DCLK1蛋白表達：制作宮頸癌組織芯片并將其連續(xù)切片，二甲苯脫蠟并在不同濃度梯度乙醇中脫水，每隔3 min用蒸餾水浸洗1次，共3次。滴加H2O2(3%)置于室溫10 min，PBS清洗后加入稀釋后的DCLK1一抗(1∶200)并置于4 ℃冰箱過夜，PBS清洗后加入二抗并置于37℃ 30 min，室溫下反應(yīng)2 h，PBS清洗后加入DAB顯色液進行顯色反應(yīng)，蒸餾水清洗后用蘇木精復(fù)染，用中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。

1.3.4 結(jié)果及療效判定：每張切片挑選5個較清晰視野對陽性染色細胞數(shù)量進行統(tǒng)計[7]。按照陽性細胞數(shù)目：陽性細胞數(shù)目<25%為0分；陽性細胞數(shù)目在25%～50%為1分；數(shù)目在51%～75%為2分；陽性數(shù)目>75%為3分。根據(jù)染色程度：未顯色為0分；黃色為1分；淡黃色棕2分；黃色為3分。取2組計分乘積：≤4分為陰性表達，>4分為陽性表達。

1.4 療效評定 根據(jù)WHO腫瘤治療療效標準對患者放療后的臨床療效進行評定[8]。完全緩解(CK)即腫瘤病灶完全消失；部分緩解(PK)即患者主要臨床癥狀基本消失；病灶穩(wěn)定(SD)即患者癥狀基本改善；疾病進展(PD)即病情惡化或出現(xiàn)新的病灶。將CR+PR作為有效組，SD+PD為無效組。

1.5 隨訪 自治療結(jié)束后開始隨訪，主要通過電話、門診等方式進行隨訪3年，并統(tǒng)計無生存進展期(progression free survival，PFS)：患者開始治療到腫瘤進展或死亡這一段時間。

2 結(jié)果

2.1 miR-15b與DCLK1 mRNA及蛋白檢測結(jié)果 宮頸癌組織中miR-15b表達低于正常組(P<0.05)，DCKL1表達高于正常組(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示DCKL1位于細胞核，染色呈黃色、淡黃色、棕黃色。宮頸癌組DCLK1陽性率高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、3，圖1。

組別miR-15b/U6DCLK1/β-actin正常組 1.05±0.041.09±0.05宮頸癌組0.26±0.02?3.30±0.12?

注：與正常組比較，*P<0.05

表3 宮頸癌組織中DCLK1蛋白表達情況 n=118，例

DCLK1陰性表達

DCLK1陽性表達

2.2 宮頸癌組織中miR-15b、DCLK1表達與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)miR-15b中位值分為高表達組36例，低表達組82例。臨床病理特征結(jié)果顯示miR-15b表達與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，DCLK1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、肌層浸潤程度有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 宮頸癌組織中miR-15b、DCLK1表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 miR-15b與DCLK1表達相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示miR-15b與DCLK1表達呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-15b與DCLK1表達水平的相關(guān)性分析

2.4 放療后宮頸癌組織中miR-15b、DCLK1表達變化與療效的關(guān)系 放療后宮頸癌組織中有效組miR-15b表達高于無效組，而有效組DCLK1表達低于無效組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

組別miR-15bDCLK1有效組(n=97)0.89±0.021.17±0.11無效組(n=21)0.23±0.013.40±0.13t值3.1242.486P值0.0000.000

2.5 宮頸癌患者放療后組織中miR-15b、DCLK1表達與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier分析顯示放療后宮頸癌組織中miR-15b、DCLK1表達與PFS相關(guān)，miR-15b高表達組PFS(71.52%)高于低表達組(18.57%)，DCLK1陰性表達組PFS(69.53%)高于陽性表達組(22.48%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、4。

圖3 放療后宮頸癌組織中miR-15b表達與PFS的關(guān)系

3 討論

近年來宮頸癌患者死亡率明顯增加，但對其病因及機制尚未完全清楚，因而尋求宮頸癌診斷的特異性標記并明確其發(fā)病機制具有重要意義[9]。目前臨床主要以手術(shù)與放療結(jié)合的方式治療宮頸癌，但由于放療敏感性、耐藥性等因素導致不同患者的治療效果出現(xiàn)不同程度差異。由于宮頸癌發(fā)生發(fā)展與癌癥相關(guān)基因的異常表達相關(guān)，研究表明miRNAs表達水平的變化可促進腫瘤細胞增殖分化及遷移從而引發(fā)宮頸癌[10]。Chen等[11]研究報道顯示部分miRNAs的異常表達與癌癥患者化療或放療的敏感性緊密相關(guān)。因此，本研究主要探討miRNAs在宮頸癌組織中的表達變化與放療敏感性的關(guān)系。

圖4 放療后宮頸癌組織中DCLK1表達與PFS的關(guān)系

miR-15b在胰腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中下調(diào)表達，并可通過不同調(diào)控機制影響腫瘤患者預(yù)后[12]。相關(guān)研究表明子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b下調(diào)表達并發(fā)揮抑癌基因的功能[13]。目前關(guān)于miR-15b在宮頸癌組織中的表達研究筆者所見相對較少，本研究通過qRT-PCR檢測宮頸癌組織及正常組中miR-15b表達，結(jié)果顯示宮頸癌組織中miR-15b表達顯著低于正常組(P<0.05)，說明miR-15b在宮頸癌組織中低表達，可能在宮頸癌組織中發(fā)揮抑癌基因的功能。根據(jù)檢測結(jié)果將miR-15b表達分為高表達組與低表達組，臨床病理特征結(jié)果顯示miR-15b表達與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均顯著相關(guān)(P<0.05)，說明miR-15b參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展進程并隨著病情進展表達逐漸降低。有研究報道顯示miR-15b與抗癌藥物或化療敏感性相關(guān)，且miR-15b可調(diào)控下游基因表達而參與藥物反應(yīng)過程[14]。本研究結(jié)果顯示與放療前宮頸癌組織中miR-15b表達水平相比，放療后宮頸癌組織中miR-15b表達明顯升高且有效組miR-15b表達顯著高于無效組(P<0.05)，說明miR-15b表達變化與放療療效及敏感性密切相關(guān)。

DCLK1是DCX家族的一員并主要參與骨架形成及調(diào)節(jié)細胞運動等過程，有研究表明DCLK1在胃癌及直腸癌組織中呈高表達且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)[15]。DCLK1可參與胰腺癌腫瘤形成過程，DCLK1陽性細胞可在胰腺癌組織中發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移并導致細胞增殖及病情惡化[16]。有研究表明DCLK1在結(jié)腸腺癌中高度表達并預(yù)測其為預(yù)防或消除結(jié)腸癌的重要靶點[17]。本研究通過qRT-PCR法檢測DCLK1在宮頸癌組織中表達水平顯著高于正常組(P<0.05)，免疫組化結(jié)果顯示宮頸癌組織中DCLK1陽性表達率顯著高于正常組(P<0.05)，說明DCLK1參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程。臨床病理特征分析結(jié)果顯示DCLK1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、肌層浸潤程度顯著相關(guān)(P<0.05)，在臨床分期及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中呈陽性表達，說明DCLK1不僅參與了宮頸癌病程進展，同時隨著宮頸癌疾病程度加重DCLK1表達逐漸增加。與放療前比較，宮頸癌組織中DCLK1表達顯著降低且有效組DCLK1表達低于無效組(P<0.05)，說明DCLK1表達變化與放療效果及敏感性有關(guān)。相關(guān)研究表明miR-195與miR-15b可共同調(diào)控靶基因SALL4表達，miR-195可通過調(diào)控靶基因DCLK1表達進而參與腫瘤細胞增殖及遷移過程且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及預(yù)后相關(guān)[18]?；诖颂接憣m頸癌組織中miR-15b是否也可調(diào)控DCLK1表達參與腫瘤細胞增殖分化過程具有重要意義，本研究采用Pearson法進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示宮頸癌組織中miR-15b與DCLK1表達呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，且放療后二者表達變化趨勢相反，說明miR-15b可能通過調(diào)控DCLK1表達而共同參與宮頸癌發(fā)生過程，同時其表達變化與放療敏感性緊密相關(guān)。此外，本研究通過Kaplan-Meier法分析放療后宮頸癌組織中miR-15b、DCLK1表達與患者PFS的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-15b高表達組PFS高于低表達組(P<0.05)，DCLK1陰性表達組PFS高于陽性表達組(P<0.05)，說明放療后miR-15b與DCLK1表達水平的變化可作為預(yù)判患者預(yù)后的重要生物學指標。本研究結(jié)果揭示miR-15b與DCLK1在宮頸癌組織中異常表達可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用且與預(yù)后不良有關(guān)，放療能有效提高miR-15b在宮頸癌組織中的表達而促使DCLK1表達降低，放療前宮頸癌組織中miR-15b與DCLK1表達與放療敏感性及臨床療效密切相關(guān)，因而測定患者宮頸癌組織中miR-15b與DCLK1表達水平對放療敏感性及患者預(yù)后預(yù)測均具有重要參考價值。

綜上所述，宮頸癌組織中miR-15b下調(diào)表達，而DCLK1上調(diào)表達，二者呈負相關(guān)關(guān)系且均參與宮頸癌病程進展過程，miR-15b與DCLK1表達變化與放療敏感性相關(guān)，二者均可能成為早期診斷宮頸癌、預(yù)測放療敏感性及評估預(yù)后的重要分子標志物。但其中的具體調(diào)控機制有待進一步研究。