劉清輝，何黎明

口腔黏膜下纖維性變(oral submucous fibrosis，OSF)是咀嚼檳榔導(dǎo)致的一種慢性、隱匿性的口腔黏膜潛在惡性病損(oral potentially malignant disorders, OPMDs)，癌變率為3.02%～9.13%[1-6]。在OSF發(fā)病期間，檳榔刺激上皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[7]，同時(shí)產(chǎn)生多種上皮轉(zhuǎn)化促進(jìn)因子[8]，抑制上皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化及凋亡[9]，導(dǎo)致組織纖維化進(jìn)一步發(fā)展。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一種表型轉(zhuǎn)換過(guò)程。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去其特征性標(biāo)志物并獲得間充質(zhì)或肌纖維細(xì)胞表型，增殖及遷移能力增加。EMT在以肺[10]、腎[11]為代表的多種器官纖維化中已有較為深入的研究。通過(guò)基因芯片與PCR技術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)檳榔堿可刺激EMT相關(guān)分子異常表達(dá)[12]。但EMT是否在OSF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用亟待進(jìn)一步研究。

核受體共激活因子7(nuclear receptor coactivator 7，NCOA7)，也被稱為ERAP140，具有激動(dòng)劑依賴性。前期研究發(fā)現(xiàn)NCOA7在口腔鱗癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移等多種生物學(xué)功能[13]，但其在OSF組織中的異常表達(dá)罕見(jiàn)報(bào)道。本研究探究NCOA7與EMT在口腔黏膜下纖維性變發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系及作用，為治療OSF提供新思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2016—2017年在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院收治符合世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)，且無(wú)其他口腔黏膜性疾病、其他系統(tǒng)性疾病的OSF患者病損組織30例和外科手術(shù)中切除的非炎性正?？谇火つそM織15例。根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理學(xué)檢查，所有OSF患者均收集的組織置于-70 ℃冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

人口腔角質(zhì)細(xì)胞株HOKs(Human Oral Kera-tinocytes)由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。 DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司，美國(guó))；BCA蛋白定量試劑盒(聯(lián)科生物公司，中國(guó))；CCK8細(xì) 胞 增 殖 及 細(xì) 胞 毒 性 檢 測(cè) 試 劑 盒(同仁公司，日本)；NCOA7兔多克隆抗體、E-cadherin兔多克隆抗體、Vimentin兔多克隆抗體、α-SMA兔多克隆抗體(Abcam公司，美國(guó))；GADPH兔多克隆抗體、兔二抗(Proteintech公司，美國(guó))；免疫組化DAB顯色試劑盒(DAKO，美國(guó))。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HOKs細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2且濕度飽和的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 免疫組化

組織固定包埋制作標(biāo)本切片,經(jīng)脫蠟經(jīng)EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH=9.0)行抗體修復(fù)。3%過(guò)氧化氫室溫孵育，PBS洗滌，封閉。PBS稀釋的一抗，4 ℃過(guò)夜。二抗37 ℃孵育1 h。PBS充分洗滌，DAB顯色，適時(shí)終止；復(fù)染，沖洗，返藍(lán)，脫水，透明，封片。所有標(biāo)本均在同一條件下染色。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀：每例隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)，染色分值及結(jié)果記錄如下：低表達(dá)記為1分(陽(yáng)性率≤25%)，中度表達(dá)記為2分(25%<陽(yáng)性率≤75%)，高表達(dá)記為3分(陽(yáng)性率>75%)。

1.5 CCK8實(shí)驗(yàn)

收集HOKs，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/L，各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，加入10 μL/孔CCK8工作液， 37 ℃孵育3 h。測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度A值。重復(fù)3次，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 Western blot

提取細(xì)胞的總蛋白，8%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉，NCOA7一抗(1∶1 000)、actin一抗(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)和E-cadherin一抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌，兔二抗(1∶5 000)常溫孵育1 h。TBST洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光法顯像并保存圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0、GraphPadprism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。NCOA7在OSF組織及正常黏膜組織中的相對(duì)表達(dá)水平采用Fisher確切概率法。其余實(shí)驗(yàn)多組數(shù)據(jù)比較用One-way ANOVA檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，采用雙側(cè)性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 口腔黏膜下纖維性變中存在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及NCOA7水平的升高

免疫組化結(jié)果顯示：在正常黏膜基底層中甚少表達(dá)的間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin在OSF組織中表達(dá)升高(圖1；χ2=11.379，P<0.05)，而E-cadherin表達(dá)降低(圖2；χ2=11.857，P<0.05)，提示在OSF中可能存在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

NCOA7免疫組化結(jié)果顯示：NCOA7在正常黏膜組織中少量表達(dá)，而于OSF上皮組織中多呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖3；χ2=39.482，P<0.05)。

圖1 免疫組化檢測(cè)Vimentin在OSF及正常組織中的差異表達(dá)

2.2 檳榔堿對(duì)人口腔角質(zhì)細(xì)胞株HOKs增殖能力的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，加入5 μg/mL檳榔堿后，HOKs增殖速率減緩，且隨著濃度的增高，增殖速率愈加緩慢，由此提示我們，檳榔堿對(duì)HOKs具有一定的抑制增殖作用。根據(jù)細(xì)胞活力=[A檳榔堿組-A空白組]/[A未加檳榔堿組-A空白組]×100%繪制曲線，可推算出EC50在7.00～13.00 μg/mL，故而本次實(shí)驗(yàn)選用10 μg/mL檳榔堿為中心濃度處理HOKs(圖4)。

圖2 免疫組化檢測(cè)E-cadherin在OSF及正常組織中的差異表達(dá)

圖3 免疫組化法檢測(cè)NCOA7在OSF及正常口腔黏膜上皮中的表達(dá)

2.3 NCOA7在HOKs中的表達(dá)隨檳榔堿濃度升高而升高

以10 μg/mL為中心設(shè)置濃度梯度(0，5，10，20 μg/mL)，用不同濃度梯度的檳榔堿刺激HOKs，24 h后提取總蛋白進(jìn)行Western blot，實(shí)驗(yàn)得出：NCOA7隨著檳榔堿的濃度升高而升高，相較于0 μg/mL組，10 μg/mL組(t=5.839，P=0.004 3)與20 μg/mL組(t=5.864，P=0.004 2)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5)。

圖4 檳榔堿對(duì)HOKs增殖能力的影響

2.4 檳榔堿對(duì)HOKs中上皮及間充質(zhì)標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平的影響

10 μg/mL的檳榔堿刺激HOKs 24 h后，E-cadherin的蛋白表達(dá)水平隨檳榔堿濃度升高逐漸下調(diào)，而Vimentin，α-SMA蛋白表達(dá)水平則隨著檳榔堿濃度升高而逐步升高(圖6)。

2.5 沉默NCOA7(siNCOA7)對(duì)HOKs中上皮及間充質(zhì)標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平的影響

siNCOA7轉(zhuǎn)染HOKs 48 h后，上皮標(biāo)記物E-cadherin的蛋白表達(dá)水平明顯下降，而內(nèi)皮標(biāo)記物α-SMA蛋白表達(dá)水平則隨著NCOA7的表達(dá)抑制而升高(圖7)。

3 討 論

OSF發(fā)病率高、可癌變，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，主要臨床表現(xiàn)有口干、黏膜燒灼感、反復(fù)水皰、黏膜大理石花紋樣變及張口受限等。檳榔堿是檳榔中的有效成分之一，研究表明檳榔咀嚼者唾液內(nèi)檳榔堿濃度均有不同程度升高，30%患者可超過(guò)10 g/L[14]。檳榔堿是OSF的關(guān)鍵致病因子， 對(duì)上皮細(xì)胞具有生物學(xué)毒性，可引發(fā)上皮轉(zhuǎn)化，促進(jìn)OSF的發(fā)生發(fā)展，而抗氧化的中藥成分參與抑制檳榔堿誘導(dǎo)的EMT過(guò)程[15]。

圖5 檳榔堿刺激下NCOA7蛋白表達(dá)水平變化

圖6 不同濃度梯度的檳榔堿對(duì)上皮及間充質(zhì)標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平的影響

有學(xué)者通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠追溯成纖維細(xì)胞來(lái)源，發(fā)現(xiàn)EMT是纖維化疾病中成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源之一[16]。但EMT在口腔黏膜下纖維性變中所產(chǎn)生的生物學(xué)作用，仍待進(jìn)一步驗(yàn)證。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)免疫組化檢測(cè)OSF組織和口腔黏膜正常組織中的上皮及間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)水平(圖1)， 發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)標(biāo)志物，如Vimentin在OSF組織中的表達(dá)明顯高于正常組織；上皮標(biāo)志物，如E-cadherin表達(dá)顯著低于正常組織，提示OSF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。E-cadherin是細(xì)胞維持上皮表型的重要粘附分子。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，細(xì)胞間的粘附性下降，細(xì)胞骨架重塑，出現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞樣表型。在許多慢性纖維化疾病中，EMT均發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。在口腔黏膜下纖維性變中，促進(jìn)EMT進(jìn)程的ZEB家族、轉(zhuǎn)錄因子超家族均有不同程度的異常表達(dá)，且這些分子的表達(dá)異常與細(xì)胞癌變、侵襲能力等生物學(xué)行為息息相關(guān)[17-18]。

圖7 沉默NCOA7后對(duì)上皮及間充質(zhì)標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平的影響

EMT與包括口腔癌在內(nèi)的多種腫瘤的轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。隨著E-cadherin蛋白表達(dá)的下降，腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞粘附力下降，侵襲能力上升。同時(shí)，有研究表明NCOA7在OSF所致的癌變組織中高表達(dá)，影響著細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)行為[13]。NCOA7具有激動(dòng)劑依賴性，可參與炎癥因子信號(hào)通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)[19-20]，并與部分癌癥的患癌風(fēng)險(xiǎn)息息相關(guān)[21]。近年來(lái)，部分學(xué)者認(rèn)為可將OSF視作早期癌變的模型[22]，而NCOA7是否在OSF中也存在著異常表達(dá)目前鮮見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們通過(guò)免疫組化及Western blot方法分析發(fā)現(xiàn)NCOA7在OSF組織，尤其是上皮組織中的表達(dá)明顯高于口腔黏膜正常組織。進(jìn)一步，我們利用不同濃度檳榔堿處理HOKs，發(fā)現(xiàn)隨著檳榔堿濃度的升高，NCOA7蛋白水平不斷升高；同時(shí)，隨著NCOA7的變化，HOKs中的上皮標(biāo)記物下降、間充質(zhì)標(biāo)記物升高。NCOA7屬于抗氧化基因OXR家族中的一員，包含1個(gè)TLDc結(jié)構(gòu)域，可參與調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激。許多證據(jù)表明氧化應(yīng)激在口腔黏膜下纖維性變[23]及EMT過(guò)程[24]中發(fā)揮著重要的作用。而NCOA7可能通過(guò)調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而參與OSF的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其具體生物學(xué)功能及機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，NCOA7、E-cadhern、Vimentin的異常表達(dá)可能與OSF發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。而分子間是否具有相互反饋機(jī)制是我們需要進(jìn)一步探索的方向。已有少量研究證明NCOA7與EMT相關(guān)分子參與癌變過(guò)程，本研究發(fā)現(xiàn)NCOA7、EMT相關(guān)分子在OSF組織及檳榔堿刺處理后的細(xì)胞中異常表達(dá)，而這些分子可能參與口腔黏膜下纖維性變的發(fā)生發(fā)展甚至早期癌變過(guò)程，為口腔黏膜下纖維性變的診治提供了新思路。