寧 芳
胚胎干細(xì)胞具有自我更新和多向分化能力,已有研究證實在適當(dāng)?shù)臈l件下胚胎干細(xì)胞可以向骨、軟骨、心肌、神經(jīng)、脂肪等不同胚層的組織分化[1-8]。這些誘導(dǎo)分化是建立在特定的誘導(dǎo)因子或者條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)條件上的[9-13]。有學(xué)者研究,胚胎干細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后可向神經(jīng)組織方向轉(zhuǎn)化,而經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后則向內(nèi)皮細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化等[14-15]。這提示如果給予胚胎干細(xì)胞特定的牙齒上皮信息,在體外是否可將其向牙齒上皮方向誘導(dǎo)分化?本研究旨在探索胚胎干細(xì)胞向牙齒上皮細(xì)胞分化的可能性,為尋找牙齒再生的種子細(xì)胞提供研究參考。
出生7 d C57小鼠。本實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會認(rèn)證批準(zhǔn)。
高糖DMEM 培養(yǎng)基(Gibco,美國);胎牛血清(Gibco,美國); Dispase(Sigma 美國); I型膠原酶(Sigma,美國); 2-巰基乙醇(Gibco,美國); 0.25%胰蛋白酶(Sigma美國);非必須氨基酸(Gibco,美國);白血病抑制因子(Gibco,美國);上皮細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco,美國);瓊脂糖(Sigma,美國);引物(上海生物工程公司);抗小鼠一抗:DSP(Santa Cruz Biotechnology,美國),AMBN(Santa Cruz Biotechnology,美國),AMGN(Santa Cruz Biotechnology,美國),CK14(Bioworld Technology,美國),DMP-1(Santa Cruz Biotechnology,美國);Hoechst 33342(Sigma,美國)。
將10只7 d C57仔鼠斷頭,分離上、下頜,僅留下頜骨。體視顯微鏡下分離下頜切牙完整牙胚,將切牙唇側(cè)面的成釉上皮小心地分離下來并剪成3段,浸泡于含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中待用。將成釉上皮組織剪碎后原代培養(yǎng),獲得單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度置1×105/mL,接種于培養(yǎng)瓶,在37 ℃,5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),2 d換液1次。待細(xì)胞完全貼壁生長后,加入0.25%胰蛋白酶消化,成纖維樣細(xì)胞脫壁,僅上皮樣細(xì)胞貼壁,加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化,換無血清上皮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),重復(fù)差別消化,直至培養(yǎng)的上皮細(xì)胞為單一上皮樣細(xì)胞(圖1)。每天換液1次(避光),置換出的培養(yǎng)液用小濾器過濾后冷藏備用。
圖1 成釉細(xì)胞的培養(yǎng)
首先消化細(xì)胞,計數(shù)。將濃度調(diào)至120 000~160 000個/mL后進(jìn)行懸滴。以25 μL一滴,均勻地滴至六孔板上蓋內(nèi)表面,隨后放置孵箱中。2 d后,在懸滴液體中可看見一個白色點狀物,即為擬胚體(圖2)。
圖2 懸滴法生成的擬胚體
將六孔板的每個孔內(nèi)放置4~5個擬胚體,培養(yǎng)擬胚體直至貼壁,棄去原有培養(yǎng)基,加入成釉細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)液進(jìn)行共培養(yǎng),每48 h換液1次,倒置顯微鏡下觀察。
RT-PCR檢測誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞是否有牙胚上皮發(fā)育早期關(guān)鍵性基因Pax9及Msx2的表達(dá),同時也檢測胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)7 d和14 d后是否有上皮細(xì)胞相關(guān)基因CK14及牙源性細(xì)胞特異性標(biāo)記物AMBN,AMGN,DMP1, DSPP的表達(dá)及其表達(dá)的差異。
將成釉細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)液誘導(dǎo) 14 d后的胚胎干細(xì)胞制備成細(xì)胞爬片。觀察免疫表型檢測結(jié)果是否與基因檢測結(jié)果相一致。其中用到的一抗分別為CK14(1∶200),AMBN(1∶200),AMGN(1∶200),DMP1(1∶200),DSP(1∶200)。
首先培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞形成擬胚體,隨后經(jīng)成釉細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)液誘導(dǎo),2 d后倒置顯微鏡下觀察,擬胚體外周開始有鵝卵石樣的細(xì)胞爬出,類似于上皮樣的細(xì)胞生成,細(xì)胞長勢良好,且隨著共培養(yǎng)時間的延長這種鵝卵石樣的細(xì)胞所占比例逐漸增加,呈放射狀生長。本實驗選取兩個時間點:7 d和14 d,鏡下觀察的結(jié)果如圖3A和B所示。
圖3 擬胚體經(jīng)成釉細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)7 d和14 d后
為了進(jìn)一步明確ASF-CM誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的分化潛能,首先對經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)3 d的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分子表型的檢測, Pax9和Msx2是較特異表達(dá)于牙胚發(fā)育最早期的兩個基因,觀察誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞是否表達(dá)這兩個基因,并將未分化的胚胎干細(xì)胞作為陰性對照。PCR結(jié)果顯示:誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞表達(dá)Pax9和Msx2,而未分化的胚胎干細(xì)胞不表達(dá)這兩個基因。誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞OCT4仍有弱表達(dá),說明胚胎干細(xì)胞并未分化完全,仍有部分細(xì)胞保留干細(xì)胞的部分特征(圖4)。圖中陰性對照為未分化的胚胎干細(xì)胞,實驗組為經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)3 d的胚胎干細(xì)胞。
圖4 誘導(dǎo)3 d后PCR檢測結(jié)果
通過對牙胚發(fā)育早期這兩個基因的檢測,初步判斷經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)后胚胎干細(xì)胞有向牙源性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢,但是隨著誘導(dǎo)時間的延長轉(zhuǎn)化效率能否增加呢?進(jìn)一步研究表明,胚胎干細(xì)胞經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)7 d后,誘導(dǎo)組可檢測到CK14、AMBN以及AMGN mRNA 的表達(dá),而未分化的胚胎干細(xì)胞則未見明顯表達(dá)。DMP1和DSPP表達(dá)陰性,誘導(dǎo)14 d后,CK14、AMBN以及AMGN mRNA 的表達(dá)水平增高。OCT4在誘導(dǎo)14 d后表達(dá)消失,證明胚胎干細(xì)胞已完全分化(圖5)。
1:未分化的胚胎干細(xì)胞;2:胚胎干細(xì)胞經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)7 d后;3:胚胎干細(xì)胞經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)14 d后
圖5胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)7d和14d后PCR結(jié)果
Fig.5PCR results after differentiated embryonic stemcells with ASF-CM for7and14days
為了進(jìn)一步驗證RT-PCR結(jié)果,隨后進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)實驗。結(jié)果表明,ASF-CM誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞14 d后,誘導(dǎo)組表達(dá)CK14、AMBN和AMGN陽性(圖6)。
圖6 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后表達(dá)CK14、AMBN和AMGN 陽性
胚胎干細(xì)胞可以通過懸滴法形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體(EBs)。擬胚體因與胚胎的早期發(fā)育相似,被廣泛用于研究器官的發(fā)育以及不同胚層間的相互作用,成為研究干細(xì)胞進(jìn)展重要的技術(shù)手段。
近幾年來,大量研究結(jié)果表明:早期的牙胚條件培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)牙源性間充質(zhì)細(xì)胞和非牙源性間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化[16-18],充分驗證了牙胚條件培養(yǎng)液中存在著一些重要的分子,這些因子之間相互傳遞的信息為牙齒的發(fā)生發(fā)育提供了適宜的微環(huán)境[19-20]?;谝陨系难芯拷Y(jié)果,設(shè)想牙齒上皮的微環(huán)境是否也是一種適宜的誘導(dǎo)微環(huán)境呢?本實驗選擇了發(fā)育期的成釉細(xì)胞并利用成釉細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)微環(huán)境,探討它能否誘導(dǎo)小鼠的胚胎干細(xì)胞向牙齒方向特別是向牙上皮方向轉(zhuǎn)化的能力。
實驗結(jié)果顯示:經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)后,胚胎干細(xì)胞可以向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,細(xì)胞的增值能力增強(qiáng)。誘導(dǎo)后的細(xì)胞部分形態(tài)為鵝卵石樣,與牙齒上皮樣細(xì)胞很相似。分化后的細(xì)胞與牙上皮形態(tài)的相似性提示胚胎干細(xì)胞向牙源性上皮方向轉(zhuǎn)化的可能性。隨后對誘導(dǎo)3 d的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞表達(dá)Pax9和Msx2,說明分化的胚胎干細(xì)胞從表型上開始向牙胚細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化,并模擬牙胚早期的發(fā)育過程。誘導(dǎo)7 d和14 d的PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞均表達(dá)CK14、AMBN、AMGN陽性,且表達(dá)量隨時間的延長而增高。CK14、AMBN、AMGN都是牙源性上皮所表達(dá)的基因,其中AMBN為牙胚上皮的特異性基因,PCR結(jié)果證明誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞在成釉細(xì)胞條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下可以較特異的向牙源性上皮細(xì)胞方向分化。結(jié)果還表明,誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)DMP1和DSPP陰性,DSPP是成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性的基因之一,DMP1在牙本質(zhì)和骨組織中均有表達(dá)。由此推論,誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞沒有向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。
為進(jìn)一步驗證PCR結(jié)果,誘導(dǎo)組誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行了免疫熒光檢測,陰性對照為未分化的胚胎干細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致。說明胚胎干細(xì)胞在體外成釉細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)液所提供的成牙微環(huán)境的誘導(dǎo)下具有分化的潛能,可向成牙上皮細(xì)胞方向分化。
然而,本實驗并沒有明確ASF-CM 中起關(guān)鍵作用的信號分子。這將是今后研究的重點。以往有研究表明,上皮培養(yǎng)液中有一些信號分子如Notch-1、TGF-βs、BMPs和FGFs等,這些分子間的相互作用可能使胚胎干細(xì)胞向牙齒上皮方向分化[21-22]。由此推論:這些發(fā)育早期的牙胚上皮細(xì)胞能夠保持成牙能力,所含的特定信號分子能夠誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向成牙方向分化。接下來的研究應(yīng)當(dāng)從如何提高誘導(dǎo)效率以及從誘導(dǎo)微環(huán)境中篩選出關(guān)鍵性的信號因子這兩方面進(jìn)一步使研究深入化。