王雪薇，唐 楠，趙知白，范 媛

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其患病率為0.5%～2.2%[1]，多見于中年女性。OLP依據(jù)臨床表現(xiàn)包括斑紋型OLP和糜爛型OLP。盡管OLP的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但OLP多與免疫系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)[2]。

人類口腔中的微生物群落約有700多種，主要由放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroid-etes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobact-eria)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)組成[3]。口腔微生物與宿主免疫密切相關(guān)，宿主的活化狀態(tài)和遺傳易感性可由特定微生物觸發(fā)或促進(jìn)[4]。宿主和微生物群的平衡關(guān)系一旦被破壞可通過不同機(jī)制引起舍格倫綜合征[5]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[6]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]等自身免疫性疾病。

目前OLP患者口腔微生物群落的研究多通過收集唾液和黏膜拭子。黏膜拭子作為一種非侵入性、低風(fēng)險(xiǎn)且省時(shí)廉價(jià)的取樣方法，多能被患者接受。He等[8]通過收集拭子發(fā)現(xiàn)OLP患者頰黏膜表面梭桿菌屬(Fusobacterium)、纖毛菌屬(Leptotrichia) 和勞特普羅菌屬(Lautropia)相對豐度顯著增加，而鏈球菌屬(Streptococcus)相對豐度在正常對照組顯著增加。為研究OLP患者口腔微生物群的變化，我們通過16S rDNA基因高通量測序，研究了斑紋型OLP、糜爛型OLP組和對照組口腔微生物群的組成概況，并評估了OLP組特定的微生物群落。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究招募2018年10—12月就診于江蘇省南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔黏膜病科的受試者，共篩選24例OLP患者(12例斑紋型OLP和12例糜爛型OLP)和8名正常對照組，所有OLP患者均符合1978年WHO對口腔扁平苔蘚的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]和2003年van der Meij等提出的臨床和病理學(xué)診斷[10]。所有受試者的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①年齡25～69 歲。②取樣前1個(gè)月無抗生素及類固醇使用史、3個(gè)月未使用免疫調(diào)節(jié)劑。③無其他已知的口腔黏膜疾病、腫瘤和嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物或銀汞材料引起的苔蘚樣反應(yīng)。②妊娠期、哺乳期及服用避孕藥者。③7 d內(nèi)使用漱口水者。④被診斷為牙周炎、牙髓病或存在可見齲病。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，且提供紙質(zhì)知情同意書，本研究程序符合赫爾辛基宣言。

1.2 樣本采集

所有OLP樣本均來源于患者頰或舌黏膜病損區(qū)的代表性部位，正常受試者樣本來源于正常的頰或舌黏膜。囑受試者漱口后，使用細(xì)胞刷(細(xì)胞收集器)緊貼在黏膜表面順時(shí)針旋轉(zhuǎn)20次收集黏膜表面微生物，立即儲存在凍存管中，置于 -20 ℃下冷凍直至進(jìn)一步分析。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)制造商的說明使用E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, 美國) 提取所有樣本的微生物DNA，PCR擴(kuò)增使用參數(shù)如下，95 ℃變性2 min，隨后在95 ℃下變性30 s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，55 ℃退火30 s， 72 ℃延長30 s，72 ℃溫育5 min。靶向16S rDNA編碼基因V3-V4高變區(qū)的通用PCR引物最終設(shè)計(jì):341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R:5′-GGACTACNNGGGTATCT-AAT-3′。

1.4 16S rDNA基因高通量測序

通過Illumina MiSeq平臺(上海凌恩生物科技有限公司)按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行配對測序(2×250)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用UPARSE(版本7.1)軟件在 97% 的相似水平下進(jìn)行 OTU 劃分，并使用UCHIME嵌合序列識別和移除。采用RDP classifier對silva (SSU132)16S rDNA數(shù)據(jù)庫中每個(gè)16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，置信閾值為70%[11]。使用Usearch 軟件(version 10)聚類和統(tǒng)計(jì)分析。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)計(jì)算各組間細(xì)菌類群的相對豐度。采用Mothur v.1.21.1[12]進(jìn)行多樣性分析，包括Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。使用UniFrac[13]進(jìn)行Beta多樣性分析，比較主成分分析的結(jié)果，使用community ecology軟件包和 R-forge (vegetarian 2.0)軟件生成PCA圖。線性判別分析效應(yīng)大小(LEfSe)分析采用Kruskal-Wallis、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)細(xì)菌分類群間的變化和差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS軟件(版本23.0,美國)。P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試者和測序結(jié)果

所有受試者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床數(shù)據(jù)見表1，3組在年齡(P=0.143)和性別(P=0.152)方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。共獲得了共1 443 822個(gè)高質(zhì)量16S rDNA序列，優(yōu)化數(shù)據(jù)的序列平均長度為423.66 bp。

表1 所有受試者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床數(shù)據(jù)Tab.1 The demographic and clinical data of all subjects

2.2 Alpha多樣性

斑紋型OLP、糜爛型OLP組和對照組的微生物豐富度(Chao1 指數(shù))和微生物多樣性(shannon指數(shù))，均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。OLP患者頰/舌黏膜微生物豐富度(Chao1 指數(shù))和多樣性(shannon 指數(shù))，也均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。

2.3 樣本間多樣性的主成分分析

我們通過基于加權(quán)的UniFrac系統(tǒng)發(fā)育距離矩陣計(jì)算beta多樣性來分析微生物群落結(jié)構(gòu)間差異，在Bray-Curtis距離主成分分析(PCA)圖(圖2A)中我們發(fā)現(xiàn)3組樣本間無明顯分離(ANOSIM，P=0.771)。在圖2B中，我們發(fā)現(xiàn)OLP組頰和舌黏膜樣本間也無明顯分離(ANOSIM，P=0.577)。

2.4 OLP組和對照組微生物群的組成差異

我們探討了OLP組口腔微生物群落特征，并比較了3組之間微生物群落的豐度差異。在門水平上的總體微生物組成(圖3A)表明，厚壁菌門是所有樣本的主要優(yōu)勢門，其次是變形菌門和擬桿菌門。在屬水平上(圖3B)，鏈球菌屬(Streptococcus)是主要的屬，其次有奈瑟菌屬(Neisseria)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)等。

A、B：斑紋型OLP、糜爛型OLP和對照組間Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)；C、D：OLP組頰與舌黏膜Chao 1指數(shù)和 Shannon指數(shù)

圖1不同分組Alpha多樣性

Fig.1Alpha diversity of different groups

A：斑紋型OLP(綠色菱形)、糜爛型OLP(紅色圓圈)和對照組(藍(lán)色正方形)；B：OLP組頰黏膜(藍(lán)色圓圈)和舌黏膜(紅色正方形)；每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，并按樣本類型著色。相似的樣本越多，其在圖中就越接近

圖2基于加權(quán)Unifrac距離矩陣的菌群主成份分析圖

Fig.2Principal component analysis of flora basedon weighted unifrac distance matrix

與對照組相比，在屬水平，艾肯菌屬和小鏈菌屬的相對豐度在OLP組顯著較高。在種水平，膿腫分枝桿菌、馬氏普雷沃氏菌、頰纖毛菌C-1013-b和苛養(yǎng)顆粒鏈球菌的相對豐度在OLP組顯著較對照組高，其中，馬氏普雷沃氏菌的相對豐度在糜爛型OLP組顯著較斑紋型OLP組高(P=0.001)。土壤桿菌屬的相對豐度在斑紋型OLP組(P=0.008)和糜爛型OLP組(P=0.032)均顯著較對照組低，但斑紋型OLP和糜爛型OLP間無顯著差異(P>0.05)。唾液鏈球菌唾液亞種在斑紋型OLP(P=0.003)和糜爛型OLP(P=0.000)的相對豐度均顯著低于對照組，且在糜爛型OLP組最低。

繪制Venn 圖(圖3C)表示3組的共享和特有的OTU。結(jié)果表明，斑紋型OLP組、糜爛型OLP組和對照組的核心OTU分別由3 554個(gè)、3 398個(gè)和5 445個(gè)OTU組成，其中2 482個(gè)OTU為3組共有。

A、B：依次為對照組、斑紋型OLP組和糜爛型OLP組在門和屬水平分類的柱狀圖；C：不同分組間微生物多樣性的Venn圖，不同組成部分中的數(shù)字表示3組間特有或共有的OTU序列數(shù)；綠色圓圈代表對照組，藍(lán)色圓圈代表斑紋型OLP組，紅色圓圈代表糜爛型OLP組

圖3微生物群組成分析

Fig.3Analysis of microbial population composition

2.5 分類豐度差異

使用LEfSe圖在不同物種水平進(jìn)行分析，通過LDA得分來區(qū)分3組的口腔微生物群落(圖4)。與對照組相比，氣球菌科(Aerococcaceae)、貧養(yǎng)菌屬(Abiotrophia)、小鏈菌屬和柯林斯菌屬(Collinsella)的相對豐度在斑紋型OLP組顯著增加。而黃桿菌目(Flavobacteriales) 、埃格特菌科(Eggerthellaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、消化厭氧桿菌屬(Peptoanaerobacter)和艾肯菌屬的相對豐度在糜爛型OLP組顯著較對照組高。小鏈菌屬和柯林斯菌屬相對豐度在OLP組顯著較對照組高。

2.6 OLP組和對照組平均相對豐度>0.2% 的屬相關(guān)性heatmap圖分析

從圖5我們可以看出，慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和葉桿菌屬(Phyllobacterium)最為正相關(guān)(ρ=0.92)，而慢生根瘤菌屬和奈瑟菌屬最為負(fù)相關(guān)(ρ=-0.56)。

2.7 未獲培養(yǎng)或難獲培養(yǎng)微生物

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌檢出率為99.89%，有0.1%的微生物屬于未獲培養(yǎng)的微生物或未分類的群體。在能夠分離培養(yǎng)出的細(xì)菌中，有0.007%的細(xì)菌在門水平未獲培養(yǎng)或難獲培養(yǎng)。

3 討 論

微生物對疾病的作用不是因?yàn)樗鼈兊拇嬖?，而是由于微生物群落組成之間的失衡[14]。了解OLP患者與正常人之間微生物群的關(guān)系，可在預(yù)防和治療OLP方面起重要作用。我們采用拭子收集的OLP病損區(qū)微生物群落，發(fā)現(xiàn)OLP組與對照組之間雖然微生物多樣性、豐富度和群落結(jié)構(gòu)方面無顯著差異，但兩組間微生物群落組成仍有不同。

A、B、C：依次為對照組和斑紋型OLP組、對照組和糜爛型OLP組、對照組和OLP組Lefse分析圖(左)和LDA得分圖(右)；僅列出LDA得分≥2

圖4各分組分類豐度差異

Fig.4Difference in abundance of classificationof each group

圓圈越大，相關(guān)系數(shù)越高；藍(lán)色代表正相關(guān)，紅色代表負(fù)相關(guān)；相關(guān)值從-1.00(紅色)到1.00(藍(lán)色)

圖5對照組和OLP組平均相對豐度>0.2%的屬Pearson相關(guān)矩陣可視化圖

Fig.5Pearson correlation matrix visualization of salivahealthy controls and OLP with genera averagerelative abundance>0.2%

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OLP組馬氏普雷沃氏菌的相對豐度顯著較對照組高，且糜爛型OLP較斑紋型OLP高。該菌可從健康受試者的齦下菌斑中分離，也可從患有牙髓和牙周感染的患者中分離[15]。Said等[16]報(bào)道厭氧菌普氏菌屬(Prevotella)與黏膜炎癥反應(yīng)有關(guān)。此外，Larsen[17]發(fā)現(xiàn)普氏菌屬豐度的增加不僅與Th17介導(dǎo)的黏膜炎癥相關(guān)，還能促進(jìn)黏膜Th17免疫反應(yīng)和中性粒細(xì)胞的募集，從而促進(jìn)慢性炎癥。本實(shí)驗(yàn)排除了患有牙髓病及牙周病的患者，因此我們認(rèn)為馬氏普雷沃氏菌豐度的增加可能與宿主免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

與對照組相比，在OLP組相對豐度顯著增加的微生物還有艾肯菌屬、膿腫分枝桿菌和苛養(yǎng)顆粒鏈球菌。侵蝕艾肯菌(Eikenellacorrodens)可引起炎癥和感染性疾病，包括種植體周圍炎[18]和髖關(guān)節(jié)感染[19]。膿腫分枝桿菌在口腔多與菌斑相關(guān)[20]，有研究表明，OLP患者牙周狀況較差[21]，因此，膿腫分枝桿菌可能參與了OLP的發(fā)展。苛養(yǎng)顆粒鏈球菌多與感染相關(guān)，如感染性心內(nèi)膜炎[22]等疾病。

此外，OLP組和對照組間微生物組成的變化還可通過某些微生物相對豐度的減少來解釋。我們發(fā)現(xiàn)斑紋和糜爛型OLP患者土壤桿菌屬相對豐度均較對照組低。Kim等[14]發(fā)現(xiàn)屬于變形菌門的土壤桿菌屬相對豐度在特應(yīng)性皮炎患者較健康皮膚低。Larsen等[23]研究表明2型糖尿病患者腸道變形菌門的比例明顯較正常對照組低。唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)具有抗炎特性，Zheng等[24]報(bào)道患有濕疹嬰兒的唾液鏈球菌相對豐度較對照低。本研究表明唾液鏈球菌唾液亞種的相對豐度在斑紋和糜爛型OLP組均低于對照組。

自然界中絕大多數(shù)微生物是未獲或難獲培養(yǎng)的[25]。雖然16S rDNA測序能夠培養(yǎng)出絕大多數(shù)細(xì)菌，但仍有少量未獲或難獲培養(yǎng)的微生物。這些微生物中可能仍存在與OLP相關(guān)的致病菌。目前，我們僅初步探討了OLP局部病損區(qū)細(xì)菌菌群。對于這些未獲或難獲培養(yǎng)的可疑微生物群可采用宏基因組學(xué)[26]、元轉(zhuǎn)錄組學(xué)[26]、反向基因組學(xué)[27]或設(shè)計(jì)針對性的PCR引物以進(jìn)行檢測。

綜上所述，口腔微生物群在人類健康中發(fā)揮著重要的作用，口腔菌群失調(diào)不僅會導(dǎo)致口腔疾病，還會導(dǎo)致系統(tǒng)性疾病，且不同疾病狀態(tài)及不同區(qū)域微生物定植情況有所差異[28]。OLP的發(fā)生和發(fā)展可能與微生物失調(diào)參與宿主免疫、炎癥和感染有關(guān)。雖然我們的樣本規(guī)模不大，但值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)OLP患者頰和舌黏膜病損區(qū)微生物多樣性、豐富度和群落結(jié)構(gòu)均無顯著差異。為充分了解OLP患者各病損區(qū)微生物群的微妙變化，仍需行大規(guī)模研究，以探索OLP特定病損區(qū)微生物群落的改變，從而有助于為OLP制定更有效的預(yù)防和治療策略。