王 婷 張浩宇 劉芝芝 樊瑋鑫 杜 方*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801； 2. 山西農(nóng)業(yè)大學 實驗教學中心，山西 太谷 030801)

花香是植物的重要特征，一方面植物通過花器官釋放揮發(fā)性成分保障授粉和結實，另一方面花香特征被植物用來吸引天敵和免受侵害[1-2]。同時，花香能擴展植物的觀賞性，對觀賞植物的觀賞價值和經(jīng)濟效益具有重要意義。百合是世界上著名的球根花卉，栽培范圍覆蓋亞洲、北美洲和歐洲，可應用于切花、盆栽和園林綠化、食品和日化等多個領域，百合的花香類型是人們選購和應用時考慮的重要因素[3]。全世界約有百合野生植物100多種，品種近10 000個[4]，各品種花香特征差異較大，是研究花香性狀的優(yōu)良材料。

花香成分微量、復雜，研究具有一定困難。近年來隨著分析技術的發(fā)展，植物花香研究逐漸增多，有關學者分別對玫瑰[5- 6]、芍藥[7]、桂花[8]、晚香玉[9]、杭白菊[10]和百合[3, 11]的花香進行了研究，并取得了一些進展。花香成分由多種易揮發(fā)的小分子化合物組成[12-13]，主要類群有萜烯類、苯類和脂肪酸衍生物[14-15]。百合花被片是主要的釋香部位[16-17]。與無香百合相比，單萜類化合物是有香百合花香揮發(fā)物的關鍵成分，其中桉樹腦、羅勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯含量較高[11]。雖然各個品種的花中具有很多相同的香氣物質，但多種揮發(fā)性成分不同比例地組合、相互作用，使得百合花香具有豐富的類型。隨著育種技術的不斷發(fā)展，市場上出現(xiàn)了越來越多的百合雜交類型，它們形態(tài)各異，花香豐富。然而，百合的花香性狀遺傳規(guī)律尚不明確，系統(tǒng)性地對百合雜交類型進行花香成分分析和遺傳規(guī)律研究較少。

本研究選擇了12種百合雜交類型共41個品種的花被片作為試驗材料，采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)聯(lián)用技術檢測每個品種花被片的揮發(fā)性成分與釋放量，并對其進行深入分析、歸納，旨在研究百合的香氣成分以及百合雜交類型之間香氣成分的關系，以期為百合香氣應用、培育新香型百合育種提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗選用的41種百合，露地種植于山西農(nóng)業(yè)大學園藝站，包括亞洲百合(A)、亞喇百合(AT)、麝香百合(L)、麝亞百合(LA)、麝東百合(LO)、 豹紋百合(LP)、頭巾百合(M)、東方百合(O)、東喇百合(OT)、喇叭百合(T)、喇亞百合(TA)和喇東百合(TO)，材料名錄見表1。選擇晴朗天的8：00—10：00 采集各品種處于盛開期(花被片完全展開，花藥開始散粉)且生長勢一致的健康植株的花被片用于揮發(fā)性成分測定，取3朵花作為一個樣品，重復測定3次。

1.2 試驗儀器

氣相色譜質譜聯(lián)用儀(GC-MS)型號為Trace ISQ，色譜柱型號為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，均產(chǎn)自美國Thermo Fisher 公司；頂空固相微萃取裝置(50/30 μm PDMS/DVB/CAR)(萃取頭及進樣器產(chǎn)自美國Supelco 公司)。

1.3 試驗試劑

標準品3-庚酮(3-Heptanone)購自德國Dr.Ehrensorfer公司。

1.4 頂空固相微萃取

稱取各品種花被片約1.5 g 置于15 mL固相微萃取專用頂空瓶中，加入3-庚酮作為內(nèi)標，試驗重復3次。用已老化好的萃取頭(Supelco公司，50/30 μm PDMS/DVB/CAR)50 ℃頂空萃取15 min。自動進樣，在進樣口解析5 min。

1.5 GC-MS分析

GC(Gas Chromatography)工作條件：色譜柱型號為DB-5MS。載氣為He，流速為1 mL/min。程序升溫過程：起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以 5 ℃/min 的速度升至270 ℃，保持6 min。

MS(Mass Spectrometry)工作條件：電離方式為 El；電離電壓為 70 eV；質譜掃描為45～600 amu；離子源溫度為 280 ℃；接口溫度為 280 ℃。

采用 Xcalibur 軟件系統(tǒng)，使用 NIST 譜庫檢索兼顧色譜保留時間確認和篩選對花朵揮發(fā)性成分進行定性分析。各化合物成分絕對含量/(ng/g)=(揮發(fā)性化合物峰面積/內(nèi)標化合物峰面積×內(nèi)標化合物含量)樣品質量[6]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用HemI 1.0[18]創(chuàng)建熱圖分析比較樣品揮發(fā)性成分；使用PAST 3.0[19]創(chuàng)建非度量多維尺度圖比較樣品揮發(fā)性成分變異模式；利用InteractiVenn工具[20]建立韋恩圖分析樣品揮發(fā)性成分數(shù)目差異。

2 結果與分析

2.1 41種百合香氣成分和組成分析

從12種百合雜交類型41個百合品種的盛花期花被片的頂空揮發(fā)物中共檢測到47種成分(圖1)，各品種中檢測到的揮發(fā)性成分的數(shù)目和種類各不相同，9種(AT1)～35種(T5)不等。將揮發(fā)性成分按生化合成途徑分類。揮發(fā)性成分的主要類群為單萜類化合物(1.44%～92.90%)、苯類化合物(1.92%～84.62%)和脂肪酸衍生物(0.35%～69.44%)。在百合的揮發(fā)物中檢測到了很多種成分，但其中絕大部分成分的相對含量很低(圖1)，而相對含量最高的成分為3種單萜類(桉樹腦、芳樟醇、(E)-β-羅勒烯)和一種酯類(苯甲酸甲酯)。研究發(fā)現(xiàn)，即使各品種所含揮發(fā)性成分的數(shù)量和質量各不相同，屬于同一雜交類型的百合品種間的相似性往往較高。

亞洲百合：在5種亞洲百合中共檢測到34種揮發(fā)性成分，共有成分有17種。苯甲酸甲酯(7.06%～39.63%)是共同的主要成分(相對含量>10%)，一些品種還含有高水平的芳樟醇(A27和A39)、桉樹腦(A21和A38)、β-石竹烯(A39)、己酸甲酯(A38)和辛酸甲酯(A38)。

表1 試驗所用植物材料名錄Table 1 List of plant materials used for researching

EDMC=2-Ethenyl-1,1-dimethyl-3-methylenecyclohexanea
圖1 41種百合揮發(fā)性成分分布熱圖
Fig.1 Heat map of scent profiles released from 41 volatile-emitting lilies

亞喇百合：從5種亞喇百合中共檢測到26種揮發(fā)性成分，共有成分有7種。總的來說，苯甲酸甲酯(5.95%～26.95%)、2-甲基丁酸甲酯(11.82%～17.35%)、萘(4.01%～15.11%)和辛酸甲酯(1.62%～15.16%)是亞喇百合的主要花香成分。在AT1和AT2中還檢測到高水平的桉樹腦(43.34%，11.93%)。同時，癸烷(2.29%～4.47%)和癸醛(0.35%～1.33%)是亞喇百合的次要組成成分(1%<相對含量<10%)。

麝香百合：在麝香百合中檢測到32種揮發(fā)性成分。主要成分是苯甲酸甲酯(30.19%)、芳樟醇(16.12%)、苯甲酸乙酯(14.40%)和2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷(12.11%)。

麝亞百合：在5種麝亞百合中共檢測到36種揮發(fā)性成分，共有成分有12種。苯甲酸甲酯(15.51%～82.22%)、芳樟醇(1.72%～33.67%)、(E)-β-羅勒烯(1.91%～32.40%)和2-甲基丁酸甲酯(1.04%～11.04%)是這5種麝亞百合的主要釋放成分。其他成分，包括月桂烯(0.54%～4.75%)、(Z)-β-羅勒烯(0.21%～3.87%)、己酸甲酯(0.19%～4.68%)和萘(0.22%～1.12%)是次要釋放成分。

麝東百合：在5種麝東百合中共檢測到38種揮發(fā)性成分，共有成分有14種。主要成分是苯甲酸甲酯(18.00%～41.88%)、2-甲基丁酸甲酯(0.64%～24.20%)和(E)-β-羅勒烯(1.09%～10.67%)。苯甲酸乙酯(0.14%～9.84%)、月桂烯(0.21%～3.63%)、己酸甲酯(0.15%～3.25%)和(Z)-β-羅勒烯(0.49%～1.64%)是次要釋放成分。同時，芳樟醇(23.77%～59.28%)也是LO2、LO3和LO4的主要成分，這3種百合的主要揮發(fā)性成分與麝亞百合相似。

豹紋百合：在豹紋百合LP1中檢測到31種揮發(fā)性成分。(E)-β-羅勒烯(25.99%)和己酸甲酯(11.02%)是LP1的主要釋放成分。

頭巾百合：在頭巾百合M1中檢測到22種揮發(fā)性成分。主要成分是苯甲酸甲酯(18.00%)、β-石竹烯(14.58%)和己酸甲酯(11.59%)。

東方百合：2種東方百合的釋放組成較為相似，在這2種百合中檢測到的34種成分中有20種共有成分。苯甲酸甲酯(25.59%～38.48%)、(E)-β-羅勒烯(18.50%～22.44%)和月桂烯(12.01%～14.67%)是東方百合的主要成分。次要成分是苯甲酸乙酯(0.28%～8.42%)、芳樟醇(4.43%～6.43%)、(Z)-β-羅勒烯(2.05%～3.97%)、(E,Z)-別羅勒烯(2.13%～3.58%)、2-甲基丁酸甲酯(2.12%～3.38%)、丁酸甲酯(0.16%～1.32%)和γ-松油烯(0.60%～1.06%)。

東喇百合：在6種東喇百合中共檢測到40種揮發(fā)性成分，共有成分有17種。這6種百合的揮發(fā)性成分差異較大，苯甲酸甲酯(30.71%～47.93%)、(E)-β-羅勒烯(2.45%～20.82%)和2-甲基丁酸甲酯(1.59%～18.50%)是它們共同的主要成分。此外，芳樟醇在OT6、OT35、OT37和OT39中相對含量較高(9.20%～23.32%)，桉樹腦在除OT39外的5個品種中相對含量較高(5.45%～17.99%)。

喇叭百合：在5種喇叭百合中共檢測到36種揮發(fā)性成分，共有成分有15種。苯甲酸甲酯(9.71%～68.46%)、桉樹腦(20.67%～60.08%)和α-蒎烯(2.97%～11.37%)是喇叭百合的主要成分。苯甲酸甲酯在除T2外的所有喇叭百合中都含量極高(34.12%～68.46%),而T2釋放出高水平的桉樹腦(60.08%)和α-蒎烯(11.37%)。包括α-萜品醇(0.35%～7.87%)、4-萜品醇(0.08%～7.31%)、(E)-β-羅勒烯(0.08%～6.40%)、水楊酸甲酯(0.39%～3.13%)、月桂烯(0.54%～2.91%)、萜品油烯(0.16%～2.61%)、γ-松油烯(0.45%～2.55%)、和β-蒎烯(0.27%～1.80%)在內(nèi)的其他化合物是喇叭百合的次要揮發(fā)性成分。

喇亞百合：在喇亞百合TA1中檢測到28種揮發(fā)性成分。主要成分是苯甲酸甲酯(38.66%)和桉樹腦(30.52%)。

喇東百合：4種喇東百合的釋放組成較為相似，在這4種百合中檢測到的31種成分中有21種共有成分。桉樹腦(41.25%～64.32%)和α-蒎烯(4.45%～14.18%)是喇東百合的主要成分。同時，4-萜品醇(1.55%～9.28%)、苯甲酸甲酯(0.51%～7.18%)、β-側柏烯(1.50%～6.53%)、2-甲基丁酸甲酯(0.49%～5.18%)、γ-松油烯(2.88%～4.73%)、萘(0.63%～4.41%)、檜烯(1.82%～3.77%)、鄰傘花烴(1.18%～3.33%)、月桂烯(1.10%～2.93%)、甲苯(0.47%～2.92%)、β-石竹烯(0.18%～2.85%)、對二甲苯(0.31%～2.08%)、β-蒎烯(0.59%～1.34%)、α-法尼烯(0.07%～1.33%)、(E)-β-羅勒烯(0.24%～1.15%)和癸烷(0.32%～1.06%)是喇東百合的次要揮發(fā)性成分。

2.2 41種百合香氣釋放水平比較

對各品種百合香氣釋放水平進行比較，發(fā)現(xiàn)各品種釋放水平差異極大(圖2)。麝香百合L1的釋放水平最高，達到23 598.60 ng/g，而亞洲百合AT1的釋放量僅有54.95 ng/g。即使同種雜交類型之間的品種也存在差異，雜交類型之間的差異更為明顯。麝香百合的釋放水平最高，其次是麝東百合(4 801.74～21 188.20 ng/g)和東喇百合(6 011.12～22 226.40 ng/g)，喇叭百合(1 232.89～13 349.04 ng/g)和東方百合(6 071.81～10 163.10 ng/g)，豹紋百合(4 565.00 ng/g)，喇東百合(1 796.78～4 093.16 ng/g)，頭巾百合(1 963.38 ng/g)和喇亞百合(1 488.01 ng/g)，亞洲百合和亞喇百合的香氣釋放水平最低，僅有 54.94～1 414.24 ng/g。

圖2 41種百合香氣釋放水平比較
Fig.2 Comparison of volatile emission levels released from 41 lilies

2.3 12種百合雜交類型香氣組成成分差異

根據(jù)百合各品種的揮發(fā)性組成成分及其相對含量進行非度量多維度尺度分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)各品種按照雜交類型或緊密或松散地聚在一起。麝香百合、麝東百合、麝亞百合和東方百合的位置比較接近，它們較其他類型百合釋放出更高比例的芳樟醇和(E)-β-羅勒烯。喇東百合和喇叭百合釋放的桉樹腦水平較高，芳樟醇和(E)-β-羅勒烯的水平低，因此和其他百合的距離較遠。東喇百合釋放的桉樹腦水平較喇東百合和喇叭百合低，釋放的芳樟醇和(E)-β-羅勒烯的水平較高，處于這幾種百合的中間位置。亞洲百合、亞喇百合和頭巾百合的位置較為接近。

選擇布雷柯蒂斯分析方法，脅強系數(shù)=0.18。
Using Bray-Curtis similarity, stress=0.18.
圖3 非度量多維尺度圖
Fig.3 Non-metric multidimensional scaling plot

2.4 香氣性狀的關系

由雜交種再次相互雜交得到的混雜交類型結合了親本的香氣性狀，用韋恩圖比較混雜交類型與親本雜交類型釋放的香氣組分(圖4)，發(fā)現(xiàn)東喇百合和喇東百合釋放的化合物在它們的親本雜交類型中也存在。麝亞百合、亞喇百合、喇亞百合中也存在這種現(xiàn)象，此外，還存在幾種在親本雜交類型中未檢測到的特殊化合物(1～3種)，可能是因為未選擇到這幾種混雜交類型的真正親本。將各混雜交類型4種主要揮發(fā)性成分[桉樹腦、(E)-β-羅勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯]的相對含量分別與親本雜交類型進行對比(圖5)，也發(fā)現(xiàn)亞喇百合和喇亞百合(圖5(a))、東喇百合和喇東百合(圖5(c))結合了親本的香氣特征。與不香的亞洲百合不同，麝亞百合揮發(fā)的桉樹腦的相對含量很低(圖5(b))，它們更多地遺傳了麝香百合親本的香氣特征，并且總香氣揮發(fā)水平處于麝香百合和亞洲百合中間(圖2)。麝東百合相較親本釋放出更高水平的芳樟醇(圖5(d))，原因可能是我們選擇的兩種東方百合的芳樟醇含量均較低，與麝東百合真正親本材料的釋放量存在差異。

(a)亞洲百合、喇叭百合、亞喇百合和喇亞百合的共有化合物；(b)亞洲百合、麝香百合和麝亞百合的共有化合物；(c)東方百合、麝香百合和麝東百合的共有化合物；(d)東方百合、喇叭百合、東喇百合和喇東百合的共有化合物。(a) The shared compounds of Asiatic hybrids， Trumpet hybrids， Asiatic×Trumpet hybrids and Trumpet×Asiatic hybrids; (b) The shared compounds of Asiatic hybrids, Longiflorum hybrids and Longiflorm×Asiatic hybrids; (c) The shared compounds of Oriental hybrids, Longiflorum hybrids and Longiflorm×Oriental hybrids; (d) The shared compounds of Oriental hybrids, Trumpet hybrids， Oriental×Trumpet hybrids and Trumpet×Oriental hybrids.
圖4 不同雜交類型香氣成分個數(shù)比較
Fig.4 Comparison of aroma components among different lily hybrid groups

3 討論與結論

不同雜交類型百合香氣差異較大，這種差異與花朵的揮發(fā)性成分有關，其香氣類型差異主要體現(xiàn)在香氣成分種類差異、品種特有香氣成分以及品種間香氣成分的含量差異中。花被片是花朵的主要釋香部位[16-17]，通過研究41種百合花被片揮發(fā)性物質的種類和含量發(fā)現(xiàn)，百合花被片的香氣成分主要是單萜類和苯環(huán)類物質，花朵呈現(xiàn)的香味主要是這些物質共同作用的結果。無香的亞洲百合和亞喇百合釋放的揮發(fā)性成分的種類和釋放量都顯著低于其他類型百合，主要成分是苯甲酸甲酯。Kong等[11]在亞洲百合‘Benfica’‘Nello’‘Navona’‘Pollyanna’和‘Renoir’的花被片中并未檢測到揮發(fā)性成分，但在亞洲百合‘穿梭’中檢測到桉樹腦、(E)-β-羅勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯等成分[16]，這些差異可能由試驗材料和收集香氣方法不同所致。麝香百合‘白天堂’的主要成分是苯甲酸甲酯、芳樟醇、苯甲酸乙酯和2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷，這與Kong等[11,16]在‘白天堂’和其他2種麝香百合檢測的結果不同，推測栽培條件可能影響百合香氣釋放。豹紋百合的主要釋放成分是(E)-β-羅勒烯和己酸甲酯，頭巾百合的主要成分是苯甲酸甲酯、β-石竹烯和己酸甲酯，這是第一次檢測到這兩種類型百合的香氣成分。東喇百合和喇東百合主要香氣成分有很大差異，東喇百合的主要成分是苯甲酸甲酯、(E)-β-羅勒烯和2-甲基丁酸甲酯，桉樹腦和α-蒎烯是喇東百合的主要成分?？傮w而言，桉樹腦、(E)-β-羅勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯的釋放量較高，推測是百合香氣的主要來源，此結果與 Kong等[11]、張輝秀等[3]、Hu等[21]從不同品種百合揮發(fā)物的成分所檢測的結果近一致。

(a)亞洲百合和喇叭百合(左)、亞喇百合和喇亞百合的分布(右)。(b)亞洲百合和麝香百合(左)、麝亞百合的分布(右)。(c)麝香百合和東方百合(左)、麝東百合的分布(右)。(d)東方百合和喇叭百合(左)、東喇百合和喇東百合的分布(右)。(a) Distribution of Asiatic and Trumpet hybrids (left), Asiatic×Trumpet and Trumpet×Asiatic hybrids (right). (b) Distribution of Longiflorum and Asiatic hybrids (left), Longiflorm×Asiatic hybrids (right). (c) Distribution of Longiflorum and Oriental hybrids (left), Longiflorm×Oriental hybrids (right). (d) Distribution of Oriental and Trumpet hybrids (left), Oriental×Trumpet and Trumpet×Oriental hybrids (right).
圖5 不同雜交類型4種主要成分[桉樹腦、(E)-β-羅勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯]組成雷達圖
Fig.5 Rader maps of different lily hybrid groups based of compositions of four major volatiles [eucalyptol,(E)-β-ocimene, linalool and methyl benzoate]

所有雜交種的表型性狀都可以追溯到它的親本[22]，與其他遺傳性狀一樣，花朵的揮發(fā)性成分也可以反映植物的遺傳規(guī)律[23]。亞洲百合的親本大部分為無香(毛百合、卷丹和川百合)或香味很淡(朝鮮百合和垂花百合)[24]，這些親本可能把這種香味特征傳遞給了它們的雜交種。喇叭百合的香氣特征可能來源于包括通江百合、淡黃花百合和王百合等有香百合以及無香百合湖北百合[11]。亞喇百合幾乎聞不到香味，推測它們的香氣特征更多地來源于亞洲百合親本。麝香百合香氣釋放強度很高，麝亞百合結合了麝香百合和亞洲百合的香氣特征，釋放強度介于兩者之間。東方百合香氣濃重芬芳，親本是有香的天香百合、鹿子百合和日本百合等百合[16]。桉樹腦在東喇百合和喇東百合中含量很高，這種重要花香組成成分來源于它們的親本喇叭百合。

同一雜交類型品種的香氣特征在一定程度上相似，在非度量多維尺度圖中往往距離較近。雜交類型之間的差異反映了它們的遺傳系譜，比較混雜交類型與親本雜交類型釋放的香氣成分個數(shù)，發(fā)現(xiàn)由雜交種再次相互雜交得到的混雜交類型結合了親本的香氣性狀。東喇百合和喇東百合都是由東方百合和喇東百合混雜而成，但是東喇百合和喇東百合無論是香氣成分組成還是非度量多維尺度圖中的位置都有差異，因此雜交時不同父母本的選擇可能導致后代香氣特征的不同。研究有助于在花香育種工作中為百合雜交親本選擇提供理論參考。