梁春娜，羅志文，鄭曄輝，陳志煌 （.廣東省開平市中心醫(yī)院，廣東開平 59300；.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 5030；3.中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東廣州 50000）

糖尿病腎病是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥之一[1-2]，在世界范圍內(nèi)，糖尿病腎病已成為導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因之一[3]。已有研究表明，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，高血糖可通過激活TGF-β1/Samd通路，導(dǎo)致細(xì)胞外間質(zhì)的沉積，進(jìn)而介導(dǎo)腎臟纖維化[4]，使患者腎功能進(jìn)一步下降，最終走向腎衰竭[5-6]，就目前而言，仍未有良好的防治手段。青蒿素是我國(guó)中醫(yī)藥學(xué)工作者從草本植物黃花蒿中提取的活性成分，有良好的抗瘧和廣譜抗寄生蟲的作用，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗炎癥、抗纖維化的作用[7-9]；亦有研究證明青蒿素類藥物對(duì)腎臟有保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討[10]。本研究通過觀察雙氫青蒿素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能的保護(hù)作用及其對(duì)腎臟纖維化的影響，探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)8周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ) ：美國(guó)Sigma公司；雙氫青蒿素：南京廣潤(rùn)生物制品有限公司；大鼠尿微量白蛋白ELISA試劑盒：南京建成生物科技有限公司；大鼠血肌酐ELISA試劑盒：南京建成生物科技有限公司；大鼠血尿素氮ELISA試劑盒：南京建成生物科技有限公司；蛋白酶磷酸酶抑制劑：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；組織蛋白提取試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；彩色預(yù)染蛋白Marker：武漢博士德生物工程有限公司；蛋白封閉緩沖液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠TGF-β1抗體、兔抗大鼠E-Cadherin抗體、兔抗大鼠Samd 3抗體、兔抗大鼠P-Samd 3抗體：美國(guó)CST公司；兔抗大鼠Fibronectin抗體：美國(guó)Millipore公司；兔抗大鼠GAPDH抗體：武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔熒光二抗：美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平：德國(guó)Sartorius公司；超低溫冰箱(－80℃)：美國(guó)Thermo公司；低溫離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀：美國(guó)Bio-Rad公司；多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司；凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析儀：美國(guó)Odyssey公司。

1.2 構(gòu)建動(dòng)物模型

從60只正常SPF級(jí)雄性SD大鼠中隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組，剩余50只使用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法構(gòu)建糖尿病大鼠模型。具體方法為：禁食12 h后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素55 μg/g(體質(zhì)量)。1周后，取大鼠尾靜脈血液，通過血糖儀測(cè)定血糖，連續(xù)3次隨機(jī)血糖＞16.7 mmol /L 并且有多飲多食多尿大鼠選定為糖尿病模型。糖尿病造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)4周，檢測(cè)尿微量白蛋白≥30 mg /L即為糖尿病腎病模型。50只大鼠中，有47只造模成功。

1.3 方法

將成功建模的糖尿病腎病大鼠(n=47)隨機(jī)分為模型對(duì)照組(n=11)、低劑量組(n=12)、中劑量組(n=12)、高劑量組(n=12)。低、中、高劑量組分別給予雙氫青蒿素10、20、40 g/(kg·d)灌胃。模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。所有組均治療8周。

1.4 觀察指標(biāo)

治療前各組大鼠禁食12 h，測(cè)體質(zhì)量、24 h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮。分別于雙氫青蒿素治療2、4、8周后，各組大鼠禁食12 h，測(cè)體質(zhì)量、24 h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮。8周末處死大鼠，提取其腎臟皮質(zhì)中的蛋白質(zhì)用于Western-blot檢測(cè)TGF-β1、 Samd 3、 P-Samd 3、 Fibronectin及 ECadherin相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在雙氫青蒿素治療8周后，糖尿病腎病模型大鼠最終存活41只，其中模型對(duì)照組10只，低劑量組11只，中劑量組10只，高劑量組10只。最終納入統(tǒng)計(jì)分析的共有大鼠51只。

2.1 雙氫青蒿素對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

使用雙氫青蒿素治療后，低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量低于正常對(duì)照組，但相較于模型對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量明顯回升(P<0.05)。不同劑量治療組間大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 雙氫青蒿素對(duì)大鼠24 h尿微量白蛋白的影響

使用雙氫青蒿素治療后，低劑量組大鼠24 h尿微量白蛋白與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而中、高劑量組在治療4、8周后24 h尿微量白蛋白下降(P<0.05)。詳見表2。

表1 雙氫青蒿素對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 (±s，g)

表1 雙氫青蒿素對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 (±s，g)

與正常對(duì)照組比較：a P<0.05；與模型對(duì)照組比較：bP<0.05

images/BZ_32_226_445_1155_515.png正常對(duì)照組模型對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 11 10 10 441.1±52.2460.3±42.7487.1±35.5 353.2±31.8a 335.4±32.1a 313.2±34.9a 411.7±52.6b 427.1±38.7b 433.7±51.5ab 408.1±58.1ab 412.8±42.6ab 428.2±54.3ab 415.6±62.3b 429.1±53.2b 432.2±48.1ab

2.3 雙氫青蒿素對(duì)大鼠腎功能的影響

使用雙氫青蒿素治療后，低、中、高劑量組大鼠的血肌酐、尿素氮較模型組明顯下降，高劑量組血肌酐、尿素氮下降更為顯著，但仍明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。詳見表3。

表2 雙氫青蒿素對(duì)大鼠24h尿微量白蛋白的影響(±s，mg/L)

表2 雙氫青蒿素對(duì)大鼠24h尿微量白蛋白的影響(±s，mg/L)

與正常對(duì)照組比較：a P<0.05；與模型對(duì)照組比較：bP<0.05

images/BZ_32_227_1436_1157_1507.png正常對(duì)照組模型對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 11 10 10 7.3±5.76.9±4.38.1±5.6 103.2±21.8a 131.1±28.4a 113.5±20.2a 101.5±22.3a 118.4±29.7a 108.3±21.1a 98.2±23.8a 78.0±11.9ab 71.5±10.7ab 100.3±24.7a 79.1±10.4ab 74.2±11.4ab

2.4 雙氫青蒿素對(duì)大鼠腎臟中蛋白表達(dá)的影響

在雙氫青蒿素治療8周后，模型對(duì)照組大鼠腎臟中的TGF-β1、Samd 3、P-Samd 3、Fibronectin蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，而E-Cadherin表達(dá)則明顯降低(P<0.05)。低、中、高劑量組與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)ibronectin和TGF-β1表達(dá)下降，E-Cadherin則明顯上升；中、高劑量組的Samd 3表達(dá)亦明顯降低，且其磷酸化水平明顯低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

3 討論

隨著生活水平的提高，我國(guó)糖尿病的患病率在逐年上升[11]。糖尿病腎病是糖尿病最重要的血管慢性并發(fā)癥之一，在我國(guó)，約有30%～40%的糖尿病患者伴發(fā)有糖尿病腎病[12]。其主要病理變化最初為腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，進(jìn)而出現(xiàn)纖維蛋白原沿基膜沉著，最終進(jìn)展為腎小球硬化，宏觀上表現(xiàn)為腎臟的纖維化[13]，截自目前為止，未能找到針對(duì)性較強(qiáng)的治療方法[14]，其預(yù)后主要取決于疾病的早診斷與早治療[15]。

TGF-β是一個(gè)有著多種功能的生長(zhǎng)因子超家族，在多種組織與器官中可促進(jìn)纖維化[17]。TGF-β1的下游存在眾多信號(hào)通路，其中Samds通路在調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)積聚過程中處于十分重要的地位[18]。其中，Samd 3屬受體調(diào)節(jié)型Samds，它的磷酸化是Samd通路激活的最重要的標(biāo)志之一。細(xì)胞內(nèi)pSamd 3表達(dá)的多少即意味著該通路激活的程度[19]。在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1/Samd通路發(fā)揮著重要的作用[20]。但是否能通過藥物調(diào)控該通路抑制糖尿病腎病的病情進(jìn)展，目前仍未有定論。

青蒿素是中藥青蒿的提取物，因其對(duì)瘧疾的治療而廣為人知[21]。已有研究證實(shí)，青蒿素及其衍生物除了抗瘧疾外，還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗纖維化的作用[22]。目前研究已證實(shí)青蒿素及其衍生物可在心臟、肝臟、肺臟、腎臟等多器官纖維化進(jìn)程中發(fā)揮作用[23-25]。其衍生物SM934可用于治療小鼠狼瘡性腎炎[26]。在大鼠實(shí)驗(yàn)性膜性腎病的研究中，SM934通過下調(diào)TGF-β1/ Samd信號(hào)通路改善大鼠腎臟損傷，減輕腎小管間質(zhì)纖維化[10]。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物之一，其可明顯延緩肝臟及肺臟的纖維化，發(fā)揮相應(yīng)的保護(hù)作用[28]。但其在腎臟中的作用尚不明確。故而，本研究旨在探討雙氫青蒿素在糖尿病腎病中可能發(fā)揮的的作用及其機(jī)制。

在本研究中，我們將健康的SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組，及低、中、高劑量組。雙氫青蒿素治療后，大鼠的體質(zhì)量回升，尿微量白蛋白減少，血肌酐及尿素氮明顯下降(P<0.05)，提示雙氫青蒿素具有一定的腎臟保護(hù)作用，且其保護(hù)作用的強(qiáng)弱可能與雙氫青蒿素的給藥劑量有關(guān)。為進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制，治療8周后，我們處死大鼠，取其腎臟組織并提取其中的蛋白用于檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)纖維化相關(guān)蛋白Fibronectin在治療后的表達(dá)明顯降低，同時(shí)，作用于上皮細(xì)胞間相互連接的蛋白E-cadherin的表達(dá)量明顯回升至正常水平(P<0.05)，證明雙氫青蒿素治療的大鼠，其腎臟纖維化水平降低甚至可能得到逆轉(zhuǎn)。在對(duì)其作用靶點(diǎn)的探索中發(fā)現(xiàn)，加入雙氫青蒿素干預(yù)后，TGF-β1/Samd通路蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變，主要表現(xiàn)為TGF-β1表達(dá)明顯下降，且與雙氫青蒿素劑量有關(guān)；同時(shí)，P-Samd 3表達(dá)亦明顯下降，提示該信號(hào)通路的活化得以抑制；且中、高劑量組的Samd 3表達(dá)亦受到影響，提示雙氫青蒿素可能影響了Samd通路蛋白的合成。此次研究結(jié)果表明，雙氫青蒿素可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)，降低Samd通路蛋白的磷酸化，甚至可能同時(shí)抑制Samd通路蛋白的合成調(diào)節(jié)腎臟纖維化的進(jìn)程。

表3 雙氫青蒿素對(duì)大鼠血肌酐、尿素氮的影響 (±s)

表3 雙氫青蒿素對(duì)大鼠血肌酐、尿素氮的影響 (±s)

與正常對(duì)照組比較：a P<0.05；與模型對(duì)照組比較：bP<0.05

images/BZ_32_207_2728_2273_2862.png正常對(duì)照組模型對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 11 10 10 30.3±5.230.9±4.330.1±5.66.1±1.26.2±1.06.1±1.0 79.1±9.1a 80.2±9.7a 79.9±8.6a 13.3±1.3a 13.6±1.2a 13.4±1.6a 77.5±11.3a 78.5±10.3a 77.5±11.3a 13.5±1.1a 12.9±1.4a 13.1±1.5a 76.2±13.8a 73.2±9.9a 71.2±10.1ab 12.2±1.8a 12.1±1.6a 12.0±1.1ab 73.3±9.7a 71.7±8.7ab 70.2±10.2ab 9.8±1.3ab 9.6±1.5ab 9.5±1.6ab

圖1 不同劑量雙氫青蒿素對(duì)大鼠腎臟中蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，雙氫青蒿素可能通過TGF-β1/Samd通路抑制腎臟纖維化的進(jìn)程，對(duì)腎臟有一定的保護(hù)作用，可改善糖尿病腎病大鼠的一般情況，為糖尿病腎病的藥物治療提供了新的理論和實(shí)踐依據(jù)。