吳 雨，苑洪霞，陳 祥*

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025）

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proli ferators-activated Receptorsγ，PPARγ）屬于激素核受體家族，是核激素受體家族中受配體激活的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，具有3種亞型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，在調(diào)控脂肪細胞分化和調(diào)控中起重要作用[1]。PPARγ作為脂肪分化的關鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，通過影響脂肪酸及其衍生物的生成發(fā)揮調(diào)節(jié)脂肪細胞的增殖和分化功能，不僅能促進脂肪細胞分化，增加脂肪細胞數(shù)量，還可間接影響其他脂肪沉積相關基因[2]。脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS）是體內(nèi)脂肪合成的關鍵酶，最早由Wakil等[3]從鵝肝臟勻漿中發(fā)現(xiàn)，位于細胞胞漿內(nèi)，通過催化乙酰CoA和丙二酰CoA生成長鏈脂肪酸，屬于神經(jīng)生長因子受體與腫瘤壞死因子受體超家族成員[4]。相關研究表明FAS基因與多種腫瘤的發(fā)生存在密切聯(lián)系[5-6]，腫瘤細胞可通過各種細胞信號轉(zhuǎn)導途徑刺激脂肪酸合成酶異常表達，從而促使脂肪酸合成[7]。白洗豬是貴州地方優(yōu)良品種，原產(chǎn)于施秉縣白洗鄉(xiāng)（今柳塘鎮(zhèn)），具有耐粗飼、適應性強、肉質(zhì)優(yōu)良等特點，深受當?shù)厝罕娤矏踇8]。蘇太豬是利用杜洛克豬和梅山豬及二花臉豬雜交合成而培育的品種，具有繁殖性能高、生長速度快、瘦肉率高、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點[9]，在前期實驗中通過雜交實驗獲得蘇白雜交F1代（SBF1代）。本實驗以白洗豬及SBF1代作為實驗對象，采用實時熒光定量PCR技術檢測2個豬種不同組織中PPARγ與FAS基因mRNA水平的表達規(guī)律，為進一步研究白洗豬和SBF1代豬脂肪沉積的調(diào)控提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物來自貴州省白洗豬種質(zhì)資源保護基地，選取飼養(yǎng)條件相同體重相近的10月齡無疾病白洗豬和SBF1代，采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、皮下脂肪和背最長肌8個組織樣。包裝編號，放入液氮罐中保存，帶回實驗室。

1.2 主要試劑 Trizol、氯仿、異丙醇，均為市購；Revert AidTM、FirstStrand cDNA Synthesis、熒光染料UItraSYBR Mixture(With ROX)、DNA Marker1000、2×Taq MasterMix，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA的提取、檢測及cDNA第一條鏈合成 按照Trizol法提取白洗豬及SBF1代各組織器官中的總RNA，用超微量紫外分光光度計測定其濃度和OD值，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性。根據(jù)Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，反應體系為40 μL：RNA Template 2 μL（800 ng/μL），Oligo(dT)18Primer 2 μL，RiboLock RNase Inhibitor 2 μL，ReverAid RT 2 μL，10 mmol/L dNTP Mix 4 μL，5×RT Buffer 8 μL，Nucleasefree Water補足至40 μL。反應條件：42℃孵育60 min，70℃孵育5 min。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進行普通PCR擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物（cDNA置于-20℃冰箱保存）。

1.3.2 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中收錄的豬（Sus scrofa）PPARγ基因（NM：214379.1）和FAS基因（NC_010456.4）mRNA序列設計引物，選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH）基因作為qRT-PCR實驗中內(nèi)參基因。運用Primer Premier5.0在線軟件設計特異性熒光引物（表1），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。

1.3.3 實時熒光定量PCR 采用SYBR Green熒光染料法在熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量。反應體系為10 μL：2×UItraSYBR Mixture 5.8 μL，PrimerSense 0.6 μL，Primer Anti-sense 0.6 μL，cDNA模板 2 μL（800 ng/μL），ddH2O 1 μL。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 13s，58℃28s，循環(huán)45次后進行溶解曲線分析，以每5 s上升0.5℃的速率從60℃升高到95℃，每個樣品檢測做3個重復，取平均值。

表1 熒光定量引物信息

1.3.4 統(tǒng)計分析 以GAPDH基因為內(nèi)參，對不同基因在組織中的表達按照2-△△Ct法計算。目的基因相對表達量=2-△△Ct，其中△△Ct=（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）-（各組織Ct值-對照組織Ct值），用Spss18.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1PPARγ、FAS基因在各組織PCR擴增產(chǎn)物的檢測 由圖1可見，擴增產(chǎn)物條帶明亮、清晰且未發(fā)現(xiàn)有引物二聚體，可用于下一步實驗。

2.2 實時熒光定量PCR的擴增曲線和溶解曲線 擴增結(jié)果顯示，在各組織器官中PPARγ、FAS基因擴增曲線呈現(xiàn)完好的“S”形狀，曲線平滑未出現(xiàn)特殊趨勢。溶解曲線均呈單峰，峰值較好，無引物二聚體，無雜峰，達到實驗要求（圖2、圖3）。

2.3 白洗豬及SBF1代豬不同組織中PPARγ基因mRNA表達分析 由圖4可知，PPARγ基因在白洗豬和SBF1代豬8個組織中均有表達，白洗豬PPARγ基因表達趨勢依次為皮下脂肪＞肝＞脾＞腎＞肺＞心＞胃＞背最長肌，其中，皮下脂肪組織中表達量極顯著高于其他各組織，其他7個組織器官之間表達差異不顯著。PPARγ基因表達量在SBF1代豬中表達趨勢為皮下脂肪＞肝＞脾＞肺＞腎＞胃＞背最長?。拘?，皮下脂肪組織中表達量極顯著高于其他各組織，其余的組織器官之間表達差異不顯著。比較白洗豬和SBF1代豬同一組織中PPARγ基因表達量，顯示白洗豬的皮下脂肪組織表達顯著高于SBF1代豬，其余組織表達不顯著。

2.4 白洗豬及SBF1代豬不同組織中FAS基因mRNA表達分析 由圖5可知，F(xiàn)AS基因在白洗豬和SBF1代豬的8個組織中均有表達，白洗豬FAS基因表達量依次為皮下脂肪＞腎＞肝＞脾＞肺＞背最長?。疚福拘?，其中，皮下脂肪組織中表達量極顯著高于其他各組織，其他7個組織器官之間表達差異不顯著。FAS基因表達量在SBF1代豬中高低順序為皮下脂肪＞肝＞脾＞背最長?。灸I＞胃＞肺＞心，皮下脂肪組織中表達量極顯著高于其他各組織，其余的組織器官之間表達差異不顯著。比較白洗豬和SBF1代豬同一組織中FAS基因表達量，顯示FAS基因在2個豬種的皮下脂肪組織表達量達到差異顯著水平，SBF1代豬的皮下脂肪組織表達量高于白洗豬，其余表達不顯著。

3 討 論

有關研究表明，PPARγ處于脂肪細胞分化調(diào)控網(wǎng)絡中心位置[10]，對脂肪細胞早期分化起到不可或缺的作用。研究表明在成纖維細胞中過表達PPARγ可以促使其向脂肪細胞分化[11]，在脂肪分化沉積過程中，PPARγ與CCAATT增強子結(jié)合蛋白α通過相互正反饋調(diào)節(jié)來促進脂肪分化與脂質(zhì)沉積[12]，尚未發(fā)現(xiàn)細胞可以在PPARγ缺失的情況下向脂肪細胞分化。本實驗以PPARγ為研究對象，對白洗豬和SBF1代的8個組織PPARγ基因mRNA進行表達水平檢測，實驗結(jié)果與PPARγ基因mRNA在肉牛[13]、肉雞[14]和八眉豬[15]中結(jié)果一致，說明PPARγ對不同物種的脂肪沉積都具有重要作用，且表達特異性趨于一致。本研究發(fā)現(xiàn)PPARγ基因白洗豬皮下脂肪組織的表達量顯著高于SBF1代，推測PPARγ基因更有利于白洗豬的脂肪沉積。

FAS在哺乳動物脂肪、肝臟、腎臟、肺臟等組織及細胞中均有表達。本實驗探究了FAS基因在白洗豬和SBF1代豬8個不同組織中的表達，結(jié)果與陳妍[16]對八眉豬、馬麗[17]對馬身豬和大白豬的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AS基因在白洗豬皮下脂肪組織的表達量顯著低于SBF1代，推測FAS基因?qū)BF1的脂肪沉積效果更顯著。

綜上，PPARγ基因和FAS基因在2個豬種的皮下脂肪中均高表達，且與其他組織差異極顯著，在白洗豬皮下脂肪組織中，PPARγ基因表達量高于FAS基因，在SBF1代豬皮下脂肪組織中，F(xiàn)AS基因表達量高于PPARγ基因，說明PPARγ基因和FAS基因都能促進白洗豬和SBF1代豬的脂肪沉積，但作用效果不同。推測PPARγ基因?qū)Π紫簇i脂肪沉積作用更大，而在SBF1代豬中FAS基因作用更顯著，故2個基因均可為影響白洗豬和SBF1代豬脂肪沉積的候選基因。