魏 岳，李海琴，唐維國(guó)，武艷平，譚美芳，劉林秀，謝金防

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西南昌 330200）

內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（ESM1）是一種硫酸皮膚素黏蛋白，ESM1蛋白的N末端具有一個(gè)富含半胱氨酸疏水殘基區(qū)域的典型信號(hào)肽序列，與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBPs）相類似，但在C端沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與其他蛋白有明顯同源的區(qū)域，因而其屬于IGFBP相關(guān)蛋白（IGFrBPs）。IGFrBPs與IGFBPs結(jié)構(gòu)相似，功能也相似，IGFrBPs主要功能有：作為胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）的載運(yùn)蛋白，延長(zhǎng)IGFs的半衰期；對(duì)特異性細(xì)胞和組織進(jìn)行識(shí)別、定位；通過(guò)調(diào)節(jié)IGFs和IGFs受體相互作用，調(diào)節(jié)IGFs的生物學(xué)效應(yīng)；不依賴于IGFs直接調(diào)節(jié)正常和惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)[1]。IGFrBPs和IGFBPs具有結(jié)構(gòu)同源性和功能的相似性，基于此學(xué)者提出IGFBPs超家族的概念[2]。ESM1基因最初從人內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆而得，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，其中外顯子2編碼一個(gè)富含苯丙氨酸的特殊區(qū)域，該區(qū)域是ESM1的重要的功能區(qū)域，雞的ESM1基因定位于Z染色體上，其蛋白與人、鼠、鵝、線蟲等的同源性達(dá)到90%以上，具有高度的保守性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，ESM1基因?qū)?xì)胞的粘附、遷移、增殖和分化等基本細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程具有重要的調(diào)控作用[5-9]。

崇仁麻雞是江西省著名的肉蛋兼用型品種，具有耐粗飼、產(chǎn)蛋率高、肉用價(jià)值高等特點(diǎn)，為家禽育種工作提供了重要素材。課題組前期對(duì)崇仁麻雞的差異性狀進(jìn)行全基因組重測(cè)序，通過(guò)基因注釋和通路分析等生物學(xué)手段，篩選與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP、SV、InDel和CNV等位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)，進(jìn)行大群體驗(yàn)證和表達(dá)規(guī)律的研究，以期尋找可以用于崇仁麻雞生長(zhǎng)性狀改良的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用的崇仁麻雞由江西省農(nóng)科院畜牧所的保種群提供，選取350只母雞，記錄4、6、8、10、12、14、16周齡和20周齡體重。出雛時(shí)，采集3只個(gè)體的心臟、肝臟、胸肌、腿肌和皮膚組織，液氮保存，提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2 試劑 基因組血液提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（Real Time PCR EasyTM-SYBR GreenⅠ）購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司；CFX型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)ESM1基因的RNA序列（GenBank登錄號(hào)為XM_428357），使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，由北京華大基因合成，引物序列如表1所示。

1.3.2 PCR-SSCP檢測(cè)

1.3.2.1 DNA和RNA提取 采用試劑盒分別提取血液基因組DNA和組織樣品中的總RNA。

1.3.2.2 SNP分型ESM1基因SNP位點(diǎn)的選取是根據(jù)前期崇仁麻雞差異性狀全基因組重測(cè)序（30×）比較結(jié)果中篩選出的與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，隨后利用Massarray SNP技術(shù)在大群體中進(jìn)行驗(yàn)證分析，由上海祥音生物科技有限公司完成。

1.3.2.3 熒光定量PCR檢測(cè) 反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR按照試劑盒（產(chǎn)品貨號(hào)：CW2582M和CW0760）說(shuō)明書進(jìn)行，利用CFX型熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性15s，60℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 利用SPSS 23.0軟件的廣義線性模型（GLM）對(duì)不同基因型與各性狀間的關(guān)系進(jìn)行最小二乘法估計(jì)及差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用2-△△Ct法檢測(cè)和計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參基因校準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果 對(duì)350只崇仁麻雞ESM1基因的3個(gè)SNP進(jìn)行基因分型，結(jié)果如圖1和表2所示，樣品成功檢測(cè)344個(gè)，每個(gè)SNP均檢測(cè)到3種基因型，其中，ES-1和ES-2位點(diǎn)位于基因的3'端，ES-3位點(diǎn)屬于第2外顯子的錯(cuò)義突變（G→A，Pro→Leu）。

2.2ESM1基因單倍型分析 利用SHEsis軟件對(duì)3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果如表3所示，ES-1、ES-2和ES-3位點(diǎn)之間存在強(qiáng)連鎖不平衡（D'＞0.8，r2＞0.33）。利用PHASE 2.1軟件計(jì)算單倍型種類及其頻率，理論應(yīng)有8種單倍型，實(shí)際得到6種，命名為H1～H6（表4）。

表1 檢測(cè)引物信息

表2 ESM1基因SNP位點(diǎn)信息

表3 ESM1基因連鎖不平衡系數(shù)

表4 ESM1基因單倍型分析結(jié)果

2.3ESM1基因單倍型組合與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析 剔除個(gè)體數(shù)較少的H1H5（n=3）和H2H6（n=1）組合，單倍型組合與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表5所示：4周齡，H1H6組合個(gè)體體重極顯著高于H1H1、H3H6和H6H6組合個(gè)體，H1H1顯著高于H6H6組合。6周齡，H1H6組合個(gè)體體重極顯著高于H1H1、H3H6和H6H6組合。8周齡，H6H6基因型組合個(gè)體極顯著低于H1H1和H1H6組合。10～12周齡，H1H1極顯著高于H6H6組合，H1H1和H1H6顯著高于H6H6組合。14周齡，H1H1組合個(gè)體極顯著高于H3H6和H6H6基因型組合，H1H6極顯著高于H3H6組合。16周齡，H1H1組合個(gè)體極顯著高于H6H6組合，顯著高于H3H6組合。20周齡，H6H6組合極顯著低于H1H1組合，顯著低于H1H6組合。

2.4ESM1基因表達(dá)規(guī)律及蛋白結(jié)構(gòu)變化預(yù)測(cè) 如表6所示，ESM1基因在所取得組織樣品中均檢測(cè)到有表達(dá)，除心臟和肝臟之間ESM1表達(dá)量差異不顯著，其余組織間表達(dá)量差異均極顯著，不同組織中表達(dá)量為胸?。酒つw＞肝臟＞心臟＞腿肌，腿肌中的表達(dá)量最低，胸肌中的表達(dá)量最高約為腿肌的60倍。

利用PredictProtein軟件預(yù)測(cè)ES-3位點(diǎn)突變引起ESM1蛋白結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果顯示，該位點(diǎn)的突變引起ESM蛋白與其他蛋白結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化（圖2），同時(shí)，突變還引起蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中螺旋結(jié)構(gòu)（H）變短以及無(wú)規(guī)則卷曲序列（L）的長(zhǎng)度和位置變化（圖3）。

3 討 論

ESM1最初被認(rèn)為是一種新穎的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的特異性分子，后發(fā)現(xiàn)其他組織也有表達(dá)，其結(jié)構(gòu)和功能與IGFBP蛋白家族相似，并能夠結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、血管內(nèi)皮因子（VGEF）和堿性成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF2）等生長(zhǎng)因子，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)，具有廣泛的生物活性[10-11]?，F(xiàn)階段有關(guān)ESM1基因功能研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域較多，主要和癌細(xì)胞的異常表達(dá)有關(guān)[12-14]。此外，張連昌[15]在流體剪切應(yīng)力和模擬始終作用后人源MG-63成骨樣細(xì)胞的基因表達(dá)譜結(jié)果中發(fā)現(xiàn)ESM1基因均顯示極顯著的表達(dá)差異，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明ESM1基因具有增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化和抑制細(xì)胞礦化的功能，ESM1基因可作為潛在的對(duì)抗失重性骨質(zhì)丟失的分子靶點(diǎn)。薛倩[16]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)┖｜S雞腿肌不同時(shí)間段差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)12周和16周相比，差異表達(dá)基因中包括ESM1在內(nèi)多個(gè)基因，GO富集顯著性分析顯示ESM1、IGFBP3、IGFBP5和IGFBP7富集到調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)功能項(xiàng)中。這些研究表明，ESM1基因與其他IGFBPs超家族成員相似，也具有調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的功能。隨著ESM1基因作用機(jī)理研究的深入，ESM1基因作為調(diào)控家禽生長(zhǎng)發(fā)育候選基因的研究會(huì)越來(lái)越多。

表5 ESM1基因單倍型型組合對(duì)崇仁麻雞生長(zhǎng)性狀的影響

表6 ESM1基因不同組織中的表達(dá)量

二代重測(cè)序技術(shù)可以在全基因組范圍篩查與目標(biāo)性狀相關(guān)的SNP、InDEL和CNV等位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)，本研究在崇仁麻雞重測(cè)序結(jié)果基礎(chǔ)上，篩選出與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的ESM1基因作為候選基因進(jìn)行大群分型并驗(yàn)證。單倍型分析發(fā)現(xiàn)ES-1、ES-2和ES-3位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖不平衡。單倍型組合與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，H1H1和H1H6組合對(duì)崇仁麻雞生長(zhǎng)性狀是2個(gè)優(yōu)勢(shì)單倍型組合，可以加強(qiáng)這2種組合的選留，而H6H6組合為劣勢(shì)單倍型組合，可以考慮剔除。本研究發(fā)現(xiàn)ESM1基因在初生雞只的胸肌和皮膚組織中表達(dá)較高，在腿肌中表達(dá)最低，推測(cè)這一結(jié)果是基因表達(dá)的時(shí)空差異以及胸肌和腿肌的肌纖維類型差異造成的。有研究表明，人ESM1基因的3'端非編碼區(qū)包含一系列的AU-富含元件（AREs），影響mRNA的穩(wěn)定性并可以被P38信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控，而第2外顯子屬于重要的功能區(qū)域，該區(qū)域編碼富含苯丙氨酸（113FPFFQY118）[17-19]。本研究中ES-1和ES-2突變位于3'端非編碼區(qū)，ES-3位點(diǎn)突變位于第2外顯子，緊鄰編碼雞ESM1蛋白富含苯丙氨酸區(qū)域（113FPFFQL118）且屬于非同義突變，經(jīng)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)可能會(huì)引起蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，因而這3個(gè)位點(diǎn)是否會(huì)造成ESM1基因表達(dá)的差異或者造成ESM1蛋白功能變化是下一步研究的重點(diǎn)，以確保ESM1基因作為崇仁麻雞生長(zhǎng)性狀分子標(biāo)記的可靠性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，ESM1基因單倍型組合H1H1和H1H6組合對(duì)崇仁麻雞生長(zhǎng)性狀為優(yōu)勢(shì)單倍型組合，可以加強(qiáng)這2種組合的選留，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示ES-3位點(diǎn)引起ESM1蛋白結(jié)構(gòu)或功能的變化，研究表明ESM1基因可作為崇仁麻雞生長(zhǎng)性狀潛在的分子標(biāo)記。