汪驍軒，高靜雯，魏殿華，高健鵬，章 蓮，張 莉，齊亞銀

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

能夠引起應(yīng)激反應(yīng)的刺激稱之為應(yīng)激源。寒冷刺激屬于應(yīng)激源的一種，能夠改變動(dòng)物機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而影響其生理和行為并產(chǎn)生許多異常反應(yīng)。動(dòng)物長期處于冷應(yīng)激環(huán)境中，會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生一系列生理反應(yīng)，如影響到血液中理化指標(biāo)、產(chǎn)肉性能、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常代謝、機(jī)體激素水平等[1]。其中脂肪代謝是體內(nèi)重要且復(fù)雜的生化反應(yīng)，指生物體內(nèi)脂肪在各種相關(guān)酶的幫助下，消化吸收、合成與分解的過程，加工成機(jī)體所需要的物質(zhì)，保證正常生理機(jī)能的運(yùn)作，對于生命活動(dòng)具有重要意義。其中脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS）與脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL）在脂肪代謝中起到重要作用。FAS基因在組織中的含量對動(dòng)物體內(nèi)脂肪代謝具有重要的調(diào)控作用，其含量的多少可以顯著影響甘油三酯（TG）在機(jī)體內(nèi)的含量[1]；LPL主要由脂肪組織和骨骼肌等所分泌的一種蛋白水解酶，主要位于血管內(nèi)皮表面，它在TG合成攜帶中起著關(guān)鍵作用，也是機(jī)體內(nèi)TG降解反應(yīng)的限速酶[1]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究強(qiáng)冷應(yīng)激后阿勒泰羊、阿勒泰和薩?？穗s交羊、阿勒泰斷尾羊的FAS、LPL基因mRNA的表達(dá)變化、血脂含量及屠宰性能，揭示冷應(yīng)激對3種綿羊脂肪的沉積和代謝的影響，初步探討冷應(yīng)激與血脂之間的關(guān)系，為新疆綿羊抗寒育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇體況相近、體重（34±4）kg 的 6月齡阿勒泰公羔羊、阿勒泰羊與薩福克雜交一代公羔羊、斷尾阿勒泰公羔羊，每個(gè)品種3只，18 只分為常溫組（15～20℃）與冷應(yīng)激組（-25～-30℃）。試驗(yàn)前和試驗(yàn)期間自由采食和飲水，每組飼養(yǎng)條件一致。飼養(yǎng)12 d后進(jìn)行屠宰，屠宰前禁食 24 h，并稱量試驗(yàn)羊的宰前活重，屠宰后分別進(jìn)行屠宰性能的測定。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（PowerWave XS2）購自美國 BioTek 儀器有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（Roche LightCycler?igh），高速冷凍離心機(jī)（Sigma，2-16k），水浴鍋（DKB-501A），PCR 儀（BIO-RAD），UVP 凝膠成像儀，超凈工作臺(tái)，低溫冰箱，電泳儀，電子稱（Sartorius group，Acculab ALC1100.2），微量移液器（eppendorf）。

1.3 主要試劑 綿羊高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、甘油三酯測試盒均購自南京建成生物科技有限公司。Trizol、DEPC、DNA Marker、Mix 購自天根生物科技服務(wù)有限公司；PrimeScript@RT Reagent kit 反轉(zhuǎn)試劑盒（批號：RR047A）購自TaKaRa公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master；異丙醇、無水乙醇購自北京華美生物工程公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 以綿羊LPL、FAS、GAPDH的cDNA為模板，利用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），引物由北京六合華大基因有限公司合成。

1.5 樣品的采集與處理 屠宰前，每只綿羊采 2 份4～5 mL血樣，均用肝素抗凝管暫時(shí)儲(chǔ)存，全部血樣采集完畢后其中1份1 000 rpm離心5min，分裝待測血漿膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的含量，分裝后的樣品存放于-20℃冰柜。屠宰后，采集阿勒泰羊、雜交羊和斷尾羊胸部肌間、肩胛間、腹股溝的脂肪，立即放入液氮罐速凍轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中進(jìn)行保存。

1.6 總 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 將采集好的胸部、腹股溝和肩胛間脂肪組織，迅速編號并放于盛有液氮的碾缽中。根據(jù)RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR擴(kuò)增。

1.7 目的基因PCR反應(yīng) 利用常規(guī)PCR反應(yīng)對組織樣品中LPL和FAS基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，mix10 μL，上、下游引 物（10 pmol/L）各 0.4 μL，超純水 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng) PCR反應(yīng)體系20 μL：模板 2 μL，SYBR 10 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算冷應(yīng)激前后阿勒泰羊、雜交羊、斷尾羊胸部肌間、肩胛間、腹股溝脂肪的各基因的相對表達(dá)量，每個(gè)組織重復(fù)3次。

1.9 血脂指標(biāo)測定 使用ELISA方法檢測綿羊血液中總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量。

1.10 屠宰性能的測定 測量綿羊活重、胴體重、凈肉重、眼肌面積、GR值、背膘厚、屠宰率、脂肪重、肌肉重、內(nèi)臟重。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行初步整理，用SPSS11.0軟件中單因素分析進(jìn)行差異性分析。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1FAS、LPL基因的RT-PCR擴(kuò)增 以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以FAS、LPL的上、下游引物擴(kuò)增，得到256、181 bp條帶（圖1）?？梢钥闯?，PCR擴(kuò)增條帶亮度明顯，說明cDNA模板擴(kuò)增穩(wěn)定。

2.2 冷應(yīng)激前后3種綿羊不同部位脂肪LPL、FAS基因含量變化

表1 基因的引物序列

2.2.1 冷應(yīng)激后阿勒泰、雜交種及斷尾羔羊不同脂肪中FASmRNA表達(dá)量的變化 由表 2可以看出，與冷應(yīng)激前相比，冷應(yīng)激后阿勒泰羊與雜交羊胸部脂肪FASmRNA的表達(dá)量升高，其中雜交羊與冷應(yīng)激前對比差異顯著，而冷應(yīng)激后斷尾羊FASmRNA表達(dá)量下降且冷應(yīng)激后FASmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)雜交羊＞阿勒泰羊＞斷尾羊；與冷應(yīng)激前相比，冷應(yīng)激后3種羔羊肩胛間脂肪FASmRNA的表達(dá)量呈升高趨勢，其中雜交羊與冷應(yīng)激前對比差異顯著且呈現(xiàn)雜交羊＞阿勒泰羊＞斷尾羊；冷應(yīng)激后3種羔羊腹股溝脂肪FASmRNA的表達(dá)量都增高，其中阿勒泰羊與斷尾羊與冷應(yīng)激前相比差異顯著且呈現(xiàn)阿勒泰羊＞斷尾羊＞雜交羊。

2.2.2 冷應(yīng)激后阿勒泰、雜交種及斷尾羔羊不同脂肪中LPLmRNA表達(dá)量的變化 根據(jù)表 3可以看出，冷應(yīng)激后阿勒泰羊與雜交羊胸部脂肪LPLmRNA的表達(dá)量增高，而斷尾羊與冷應(yīng)激前相比呈顯著下降趨勢且冷應(yīng)激后FASmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)雜交羊＞阿勒泰羊＞斷尾羊；冷應(yīng)激后肩胛間脂肪LPLmRNA的表達(dá)量冷應(yīng)激組呈升高趨勢，其中雜交羊和斷尾羊與冷應(yīng)激前對比差異顯著且呈現(xiàn)雜交羊＞斷尾羊＞阿勒泰羊；冷應(yīng)激后三種羔羊腹股溝脂肪LPL的表達(dá)量都顯著上升且呈現(xiàn)阿勒泰羊＞雜交羊＞斷尾羊。

2.3 冷應(yīng)激前后3種綿羊血脂指標(biāo)變化 根據(jù)表 4可以看出，冷應(yīng)激后阿勒泰羊與雜交羊血液中T-CHO含量顯著高于應(yīng)激前，斷尾羊應(yīng)激后T-CHO含量與冷應(yīng)激前常溫條件下相比顯著降低；冷應(yīng)激后阿勒泰羊與斷尾羊血液中TG含量升高，阿勒泰羊與冷應(yīng)激前相比差異顯著，冷應(yīng)激后雜交羊TG含量有所下降；3種羊冷應(yīng)激后血液中HDL含量高于冷應(yīng)激前且雜交羊與斷尾羊差異顯著；3種羊冷應(yīng)激后血液中LDL顯著高于冷應(yīng)激前。

2.4 冷應(yīng)激前后3種綿羊屠宰性能變化 根據(jù)表 5可以看出，3種羊冷應(yīng)激后與冷應(yīng)激前常溫條件下相比，宰前活重、胴體重、脂肪重、肌肉重、肉重、骨重、肉骨比、屠宰率、凈肉率、背膘厚、GR值、眼肌面積均有所下降，其中胴體重、肌肉重、肉重、骨重、背膘厚、GR值、眼肌面積差異顯著，皮重有所上升，臟器變化不明顯。

表2 冷應(yīng)激前后綿羊FAS mRNA 的表達(dá)量

表3 冷應(yīng)激前后綿羊LPL mRNA的表達(dá)量

表4 冷應(yīng)激前后綿羊血脂指標(biāo)變化 mmol/L

表5 冷應(yīng)激前后綿羊屠宰性能變化

3 討 論

3.1 冷應(yīng)激對綿羊FAS、LPL基因含量變化的影響 機(jī)體內(nèi)脂肪的合成代謝與分解代謝始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，其中主要是由TG的酯化和分解2個(gè)過程主導(dǎo)，其相對速度決定了脂肪的分解或儲(chǔ)存狀態(tài)。FAS是脂肪酸合成的主要關(guān)鍵酶，其活性的高低直接控制著脂肪合成的強(qiáng)弱，F(xiàn)AS基因是體脂沉積性狀和肉質(zhì)性狀的重要候選基因[2-3]。LPL則主要催化乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的TG水解成甘油和脂肪酸，其對脂肪酸運(yùn)輸和脂肪細(xì)胞能量代謝有重要調(diào)節(jié)作用。LPL活性的高低是脂肪蓄積程度的最早標(biāo)志之一。因此通過對FAS和LPL基因的研究有助于深入了解脂肪合成與代謝過程。

張權(quán)[4]與楊恒東等[5]對雞組織LPLmRNA 表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果均顯示雞的肝臟、腹脂和肌肉等組織LPLmRNA 表達(dá)量有顯著差異，其中楊恒東[5]研究結(jié)果中表達(dá)量依次為肌肉＞腹脂＞肝臟，張權(quán)[4]的研究結(jié)果為肝臟＞腿?。拘丶。靖怪?。它在脂肪以及不同部位肌肉中的表達(dá)量最終會(huì)影響這部分脂肪是究竟是用來儲(chǔ)存還是氧化分解提供能[1]。本實(shí)驗(yàn)不同品種的綿羊組織LPLmRNA 表達(dá)量存在組織差異，而寒冷應(yīng)激后阿勒泰羊腹股溝脂肪＞肩胛間脂肪＞胸部肌間脂肪，雜交羊與斷尾羊肩胛間脂肪＞腹股溝脂肪＞胸部肌間脂肪，這與張權(quán)[4]、楊恒東等[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相符，可能是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同，而且前期也沒有任何冷處理。本研究中冷應(yīng)激下阿勒泰羊主要?jiǎng)訂T腹股溝脂肪，而雜交羊和斷尾阿勒泰羊主要?jiǎng)訂T肩胛間脂肪，說明不同品系綿羊各個(gè)部位脂肪LPL含量存在差異，冷應(yīng)激下動(dòng)員的脂肪部位也會(huì)有所差別，表明LPLmRNA表達(dá)量具有組織特異性，且冷應(yīng)激下主要影響了肩胛間脂肪和腹股溝脂肪的動(dòng)員，使機(jī)體產(chǎn)熱量增加，以抵抗冷應(yīng)激。

FAS是脂肪酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶，主要作用是合成長鏈脂肪酸。多數(shù)研究表明，熱應(yīng)激可以增加脂肪沉積的趨勢[6]，動(dòng)物體脂沉積所需要的脂肪酸大多是來自脂肪酸的合成。劉梅[7]研究發(fā)現(xiàn)，急性熱應(yīng)激顯著增加了肉仔雞肝臟FASmRNA 相對表達(dá)水平，從而促進(jìn)了肝臟的脂肪酸合成，同時(shí)急性熱應(yīng)激對腹脂F(xiàn)AS表達(dá)量沒有顯著影響。單體中等[8]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS基因在1 日齡到 28 周齡仔豬腹脂中的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冷應(yīng)激后阿勒泰羊與雜交羊胸部脂肪FAS含量升高，其中雜交羊與常溫組對比差異顯著，而冷應(yīng)激后斷尾羊比常溫組表達(dá)下降；冷應(yīng)激后3種羊肩胛間脂肪FAS含量與常溫組對比呈升高趨勢，其中雜交羊差異顯著；冷應(yīng)激后3種羊腹股溝脂肪FAS含量都增高，且阿勒泰羊與斷尾羊與常溫組對比差異顯著。本實(shí)驗(yàn)中，冷應(yīng)激后阿勒泰羊與斷尾羊FASmRNA表達(dá)情況為腹股溝脂肪＞肩胛間脂肪＞胸部肌間脂肪，雜交羊?yàn)榧珉伍g脂肪＞胸部肌間脂肪＞腹股溝脂肪。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激前后肩胛間脂肪和腹股溝脂肪中FAS和LPL基因變化趨勢相同，但冷應(yīng)激前后LPL的表達(dá)量的差值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FAS表達(dá)量的差值，這說明了在冷應(yīng)激下機(jī)體耗能增加，脂肪代謝加快，集體總體呈現(xiàn)脂肪消耗大于合成過程。

4.2 冷應(yīng)激對綿羊血脂指標(biāo)影響 正常生理狀態(tài)下，T-CHO濃度與LDL和HDL的含量有關(guān)，可能還與類群等因素有關(guān)。李柔[9]實(shí)驗(yàn)表明，冷應(yīng)激會(huì)使肉雞體內(nèi)膽固醇含量升高；而梁鴻雁等[10]實(shí)驗(yàn)表明，在冷應(yīng)激環(huán)境中，奶牛乳清膽固醇含量與正常對比無顯著變化。這說明冷應(yīng)激對T-CHO的影響可能與動(dòng)物種類有關(guān)。本研究表明，冷應(yīng)激后阿勒泰羊與雜交羊血液中T-CHO含量高于應(yīng)激前且差異顯著，機(jī)體內(nèi)T-CHO含量的高低與血脂的代謝過程有關(guān)，說明了冷應(yīng)激可能會(huì)對阿勒泰羊和雜交羊血液中膽固醇的代謝造成一定的影響；而斷尾羊應(yīng)激后T-CHO含量與應(yīng)激前相比顯著降低，可能斷尾后在冷應(yīng)激環(huán)境下其加速了膽固醇的代謝。

白色脂肪組織中的TG是高等動(dòng)物主要的能量儲(chǔ)備物。任冰穩(wěn)等[11]觀察束縛應(yīng)激后大鼠血脂和PPARα、L-CPT-ImRNA和蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激后大鼠血清中游離脂肪酸（Free Fatty Acid，F(xiàn)FA）、TG和HDL-C水平升高。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過冷應(yīng)激之后，阿勒泰羊與斷尾羊血液中TG含量升高，冷應(yīng)激后雜交羊TG含量有所下降，這與任冰穩(wěn)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，說明雜交品系胴體質(zhì)量發(fā)生改變后，其在冷應(yīng)激過程中其血脂的代謝也會(huì)有所差異。

LDL-C可反映低密度脂蛋白（LDL）的多少，HDL-C作用亦是如此。高密度脂蛋白（HDL）是血清蛋白的一種，主要功能是促進(jìn)脂肪分解，俗稱“血管清道夫”。LDL是富含膽固醇的脂蛋白，主要功能是把膽固醇運(yùn)輸?shù)饺砀魈幖?xì)胞，過多的 LDL會(huì)使膽固醇黏附于血管壁造成各種疾病。有研究表明，不同冷應(yīng)激持續(xù)時(shí)間下，肉雞體內(nèi)HDL、LDL含量有波動(dòng)性變化，總體趨向增加[9]。本研究表明，在冷應(yīng)激條件下3種羊血液中HDL 與LDL含量都高于冷應(yīng)激前，但阿勒泰羊HDL與冷應(yīng)激前差異不明顯，可能是因?yàn)樵诤洵h(huán)境下，TG分解增多從而導(dǎo)致LDL增多，而HDL與LDL在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡，所以HDL含量也會(huì)有所升高，說明冷應(yīng)激對3種綿羊HDL與LDL都有一定的影響。

4.3 冷應(yīng)激對綿羊屠宰性能影響 冷應(yīng)激不僅影響動(dòng)物機(jī)體的生物化學(xué)代謝，也影響動(dòng)物脂肪沉積，引起骨肉比改變，從而影響其生產(chǎn)性能。有研究報(bào)道，嚴(yán)寒環(huán)境對動(dòng)物肉質(zhì)指數(shù)影響較大，使背膘中的單不飽和脂肪酸濃度升高，多不飽和脂肪酸濃度降低，也易產(chǎn)生PSE肉[12]。田允波[13]發(fā)現(xiàn)豬飼養(yǎng)在低溫條件下時(shí)，因?yàn)樵诤洵h(huán)境中生長的時(shí)間太長，使其與適宜溫度下圈養(yǎng)的豬相比，耳、尾、吻突和鼻以及腿均顯示出短小的形態(tài)特征，體脂的囤積大部分集中在腹腔里，并且皮下脂肪較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種羊冷應(yīng)激后宰前活重、胴體重、脂肪重、肌肉重、肉重、骨重、肉骨比、屠宰率、凈肉率、背膘厚、GR值、眼肌面積均有所下降，其中胴體重、肌肉重、肉重、骨重、背膘厚、GR值、眼肌面積差異顯著，皮重有所上升，臟器的變化不明顯。說明在寒冷環(huán)境中，綿羊?yàn)榱说钟洌枰竦拿さ钟湟约跋母嗟闹緛砭S持正常生理活動(dòng)，從而會(huì)影響其脂肪與肌肉的含量。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激后3種羊的屠宰率與凈肉率均有所下降，說明冷應(yīng)激對屠宰性能有一定的影響；而冷應(yīng)激對3種綿羊臟器影響較小，冷應(yīng)激前后臟器重量未發(fā)生大的變化。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過檢測FAS和LPL基因在3種綿羊體內(nèi)冷應(yīng)激后的mRNA表達(dá)量以及血脂指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，3種羊不同部位脂肪代謝效果不相同，從整體上看，阿勒泰羊脂肪代謝速度最慢；此外，3種羊血液指標(biāo)發(fā)生一定變化，并且冷應(yīng)激對雜交羊和斷尾羊影響大于對阿勒泰羊影響。以上結(jié)果說明了在寒冷環(huán)境下3種綿羊都會(huì)消耗一部分脂肪來為機(jī)體提供能量去適應(yīng)外界環(huán)境的變化，但雜交羊和斷尾羊相較于阿勒泰羊會(huì)消耗更多的脂肪來供能。