陳 龍 ， 楊玉琪， 馮子奕， 李雪蕊， 韓子偉， 馬克濤， 司軍強， 李 麗

(1. 石河子大學醫(yī)學院生理教研室， 新疆 石河子832002； 2. 新疆軍區(qū)總醫(yī)院第951醫(yī)院， 新疆 庫爾勒 841000； 3. 嘉興學院醫(yī)學院， 浙江 嘉興 314000； 4. 中國人民解放軍69340部隊， 新疆 阿勒泰 836100)

老年性耳聾(presbyacusia)，又稱年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss,AHL)，是指耳蝸聽覺功能隨年齡增長而下降，同時伴有感覺毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞缺失等[1]。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)是聽覺傳導通路中的第一級神經(jīng)元，螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元發(fā)生年齡相關(guān)性退化是AHL外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展的主要原因[2]。雌激素是一種類固醇類性激素，研究表明，雌激素對聽力有一定的保護作用[3, 4]，雌激素替代治療，可減少女性圍絕經(jīng)期的聽力損失[5]，提示雌激素可減緩聽力下降，但其機制尚不明確。本實驗以老年C57BL/6J小鼠為AHL模型，分別施行卵巢去除術(shù)，外源性雌激素替代，觀察AHL中雌激素對于螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元缺失及細胞凋亡的影響，來探討雌激素對AHL的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物由北京維通利華動物中心提供，選取無耳疾C57BL/6J雌性小鼠40只，體重25～35 g,按不同年齡分為：3月齡(3 m)組10只，12月齡(12 m)組30只。將12月齡組再根據(jù)干預措施隨機分成3組,每組10只：12 m組為12月假手術(shù)組；12 m OVX 組(12月去卵巢組)在9月齡行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，正常飼養(yǎng)至12月齡；12 m OVX+E2組(雌激素干預組)在9月齡行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，經(jīng)過1月洗脫期后，給予皮下注射雌激素100 μg/(kg·d)，持續(xù)2月至12月齡。其他各組小鼠正常喂養(yǎng)，至12 m OVX+E2組小鼠給藥結(jié)束后，同時檢測3月齡組與12月齡各組小鼠ABR閾值，分別采尾靜脈采血，檢測小鼠血清雌激素水平，用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頸后取雙側(cè)耳蝸，分別用于石蠟切片與QRT-PCR檢測。所有小鼠低噪音環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，濕度為40%～50%，溫度為20～24℃。飼養(yǎng)及實驗過程嚴格遵守《石河子大學醫(yī)學倫理委員會條例》。

1.2 儀器與試劑

LSM510激光共聚焦顯微鏡(CarlZeiss公司，德國)，顯微手術(shù)器械(六六視覺公司，中國)，多功能熒光酶標儀(SANYO公司，日本)，熒光定量PCR檢測(Bio-Rad公司，美國)，顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)。17β雌二醇(Sigma，美國)，TUNEL染色試劑盒(英國Roche公司)，戊巴比妥鈉(隆盛化工有限公司，中國)，雌激素檢測試劑盒(克隆云，中國武漢)，HE染色染料(sigma公司，美國)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附( ELISA) 法檢測小鼠血清雌激素水平

各組小鼠麻醉后，尾靜脈采血，每只小鼠取血0.6 ml～1.0 ml，血液室溫靜置30 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液(即血清)分裝于1.5 ml的EP管中，于-20℃或-80℃保存?zhèn)溆茫苊夥磸蛢鋈?，按照雌激素檢測試劑盒說明書進行相關(guān)檢測，用酶標儀測量各孔的吸光度(OD值)，注意實驗過程中各孔內(nèi)避免氣泡產(chǎn)生。

1.4 聽性腦干反應(ABR)閾值測試

腹腔注射2%戊巴比妥鈉將小鼠麻醉后置于隔聲屏蔽室內(nèi)，記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于雙側(cè)乳突，接地電極置于鼻尖。耳機離受測外耳道口1 cm，聲音刺激為短聲，雙耳、21.1 Hz。掃描時間10 s，疊加次數(shù)1024，刺激間隔11.10次/ s，最大刺激聲強度為90 dB，首先以10 dB 遞減刺激聲，當接近閾值時以5 dB nHL遞減，以能分辨出可重復的 ABR 的Ⅲ波的最低刺激強度作為 ABR 的反應閾值，并重復至少3次，取其均值作為閾值。

1.5 耳蝸的HE染色

用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，生理鹽水及4%多聚甲醛灌注固定，斷頸后迅速取出雙側(cè)耳蝸，置于4%多聚甲醛中，4℃固定24 h;置于10%EDTA脫鈣1周，脫鈣后，去除標本余骨，進行梯度脫水透明。將耳蝸于平行蝸軸方向浸蠟包埋，平行蝸軸方向連續(xù)切片(3 μm)。

HE染色：挑選組織結(jié)構(gòu)完整的石蠟切片進行實驗，蘇木精染色5 min，沖洗3 s，1%鹽酸酒精10～15 s，蒸餾水沖洗，伊紅染色3 min，梯度酒精脫水，二甲苯使其透明，中性樹膠封片。

1.6 耳蝸的TUNEL染色檢測細胞的凋亡率

石蠟切片脫蠟，放入檸檬酸鹽溶液中煮沸15 min，用原位細胞死亡檢測試劑盒標記，耳蝸切片與標記的核苷酸和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的混合物暗室孵育(37℃，1 h)，應用olympus激光共聚焦顯微鏡觀察，Imgae-Pro Plus 6.0軟件分析，軟件統(tǒng)計凋亡細胞與正常細胞的比值，進而計算細胞凋亡率。

1.7 耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的實時熒光定量PCR

無菌條件下取各組小鼠耳蝸，去除蝸殼，基底膜及螺旋韌帶，取出中軸，采用RNeasy Mini Kit試劑盒提取總RNA，70℃預變性5 min，42℃退火60 min，4℃延伸5 min反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，擴增目的基因和內(nèi)參。QRT-PCR反應條件：95℃預變性2 min，95變性5 s，60℃退火10 s，循環(huán)40次。所有數(shù)據(jù)均使用2-△△CT方法進行處理方法進行處理，目的基因引物序列如表1所示。

Tab. 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清雌激素水平的檢測

為驗證雌鼠去卵巢模型及外源性給予雌激素模型制備成功，我們應用ELISA檢測各組小鼠血清雌激素水平。結(jié)果顯示，各組小鼠雌激素水平比較，3 m組與12 m組，雌激素水平差異無統(tǒng)計學意義，12 m OVX組較12 m組，雌激素水平顯著降低(P< 0.01)；與12m OVX組相比，12 m OVX+E2組雌激素水平顯著上升(P<0.01，表2)；而與12 m組相比，12m OVX+E2組雌激素水平差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示：小鼠去卵巢模型制備成功，且外源性給予雌激素后，小鼠體內(nèi)雌激素水平與12月齡雌鼠一致，雌激素干預組制備成功。

Tab. 2 Comparison of estrogen levels, ABR response threshold and Apoptosis rate of helical ganglion cells in 4 groups of n=10)

2.2 小鼠聽性腦干反應(ABR)閾值檢測

ABR結(jié)果顯示，隨小鼠年齡增長，ABR閾值逐漸增高，聽力下降，12 m組相對3 m組,閾值明顯高(P<0.01)，小鼠聽力明顯降低；去卵巢后，閾值較正常小鼠下降，12 m OVX組相較12m組，閾值增高(P<0.01)，聽力降低；給予雌激素后，12 m OVX+E2組相對12 m OVX組，閾值明顯降低(P<0.01)，聽力有所改善,提示雌激素對聽力有一定的保護作用(表2)。

2.3 小鼠耳蝸組織學HE染色

3 m組螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細胞豐富且排列整齊緊湊，核漿比例正常。12 m組神經(jīng)細胞數(shù)量減少，核漿比例開始失調(diào)。12 m OVX組螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)細胞形狀不規(guī)整且排列紊亂，細胞核固縮，染色質(zhì)邊聚。相比之下12 m OVX+E2 組損傷神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少，細胞結(jié)構(gòu)相對完整(圖1，見彩圖頁Ⅰ)。

Fig.1 Cochlear tissue HE staining（×400）

2.4 小鼠耳蝸TUNEL 染色檢測螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡

為觀察老年過程中耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡情況，以及雌激素對凋亡的保護作用，應用TUNEL染色觀察各組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡(圖2，見彩圖頁Ⅰ)。各組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)TUNEL 染色結(jié)果顯示(表2)：12 m 組較3 m組細胞凋亡顯著增高(P< 0.01)；12 m OVX組較12 m組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡增高(P<0.01)；12 m OVX+E2組較12 m OVX組凋亡降低(P<0.01)。提示雌激素可抑制螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。

Fig.2 Cochlear spiral ganglion TUNEL staining was performed in each group（×400）

2.5 小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)上凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達水平

應用QRT-PCR技術(shù)，在mRNA水平觀察螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA水平的變化。結(jié)果顯示：12 m組較3 m組，凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平升高(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平降低(P<0.01)，12 m OVX組相較12 m組，凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平升高(P< 0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平降低(P< 0.01)，12 m OVX+E2組相對12 m OVX組，凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平降低(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平升高(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義(表3)。結(jié)果顯示雌激素可下調(diào)老年小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平。

Tab. 3 mRNA levels of apoptotic proteins in spiral ganglion of n=6)

3 討論

老年聾是老年人群中最常見的感覺功能障礙，據(jù)報道，雌激素對老年聾有一定的保護作用，但這種作用通過何種途徑實現(xiàn)，尚不明確。本實驗選取C57BL/6J小鼠作為老年聾模型，通過觀察衰老過程中螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡以及雌激素對其凋亡的影響，探討雌激素通過抑制螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，實現(xiàn)對老年聾的保護作用。

C57BL/6J小鼠是Cdh23基因突變的近交系小鼠，特點為進行性聽力喪失和性早熟，是老年聾研究最常用的模型鼠[6, 7]。本實驗選取3月齡小鼠為年輕組，12月齡為衰老組，ABR檢測12月齡小鼠聽力閾值明顯升高。有研究報道，在正常的大鼠中，切除卵巢會導致ABR閾值的升高，而雌激素替代可以逆轉(zhuǎn)這些變化[8]。且雌激素替代治療，可改善小鼠畸變發(fā)聲產(chǎn)物(DPOAEs)以及聽性腦干反應(ABR)振幅和潛伏期[9]。在我們的研究中，去除小鼠卵巢后，體內(nèi)雌激素水平降低，ABR閾值較正常老年雌鼠升高，而外源性給予雌激素后，小鼠體內(nèi)雌激素水平維持在正常雌鼠的生理濃度，ABR閾值較去卵巢小鼠降低，結(jié)果與上述實驗一致，提示體內(nèi)穩(wěn)定的雌激素水平，對老年小鼠的聽力損失有一定的保護作用。

神經(jīng)性老年聾是老年聾中最常見的一種類型，主要以耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元漸行性退化為主，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的壞死或凋亡是老年聾的重要機制之一[10]。目前已有研究初步顯示雌激素對聽力的保護作用可能與其對神經(jīng)元的保護作用相關(guān)。而雌激素可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子[8]，抑制細胞凋亡[11, 12]等途徑發(fā)揮對神經(jīng)細胞的保護作用。本實驗通過HE染色觀察耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)形態(tài)變化，結(jié)果顯示老年C57BL/6J小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少，核漿比例開始失調(diào)；而去卵巢后，螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)細胞形狀不規(guī)整且排列紊亂，細胞核固縮；在給予雌激素后，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損傷程度明顯改善。結(jié)果提示，雌激素在老年聾過程中，可減少螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的缺失。在聽覺系統(tǒng)中，螺旋神經(jīng)節(jié)以及毛細胞的損傷是不可逆的，這將導致永久性的感音神經(jīng)性耳聾。目前，沒有預防或治療老年聾的有效藥物，只能通過助聽器進行擴聲或通過人工耳蝸進行電刺激來改善聽力，其中人工耳蝸可以通過直接電刺激螺旋神經(jīng)節(jié)來有效替代失去的毛細胞的機械感官轉(zhuǎn)導功能，但只有保留了足夠多的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞時，才能發(fā)揮其作用[13]，因此對于螺旋神經(jīng)節(jié)的保護作用，在老年聾的防治中十分重要。研究顯示，敲除雌激素受體ERβ后，12月齡小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞減少，而雌激素配體與受體可相互調(diào)節(jié)[12]，因此穩(wěn)定的雌激素水平可能有助于維持雌激素受體的數(shù)量和功能，從而延緩聽覺神經(jīng)元的變性。

研究發(fā)現(xiàn)小鼠耳蝸中凋亡途徑隨年齡增長而上調(diào)，年齡相關(guān)性的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的缺失，可能與凋亡相關(guān)[14]。但螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡在老年聾發(fā)生發(fā)展過程中的機制尚不明確。已知雌激素可以通過抑制神經(jīng)細胞凋亡，增加神經(jīng)元存活率[15]。我們通過TUNEL染色觀察小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡情況[16]，老年小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡增高，去卵巢小鼠較正常老年雌鼠，凋亡加重，而給予外源性雌激素后，凋亡減少。為進一步觀察老年聾過程中螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡程度，應用QRT-PCR檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2mRNA水平的變化。我們觀察到，老年小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)，Caspase-3 、Bax mRNA水平升高，而抗凋亡因子Bcl-2降低，這些結(jié)果表明凋亡途徑參與耳蝸衰老過程螺旋神經(jīng)節(jié)的缺失。在去卵巢小鼠中，與正常老年雌鼠相比，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)凋亡蛋白Caspase-3 、Bax mRNA水平明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平顯著降低，給予雌激素后凋亡蛋白Caspase-3 、Bax mRNA水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平顯著升高。以上結(jié)果提示，雌激素可抑制衰老過程中螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。

在老化的耳蝸中，谷氨酸興奮毒性可能導致螺旋神經(jīng)節(jié)凋亡，而雌激素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被證明可抑制谷氨酸興奮性毒性誘導的神經(jīng)元損傷和細胞凋亡[17]。另外，雌激素通過抑制JNK促凋亡通路，能夠減少慶大霉素誘導的HCs凋亡[18]。雌激素還可以通過上調(diào)抗凋亡因子來抑制ROS誘導的耳蝸HCs凋亡。其中，已知E2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可上調(diào)神經(jīng)元中的Bcl-2和Bcl-XL，這些基因中ERE序列的存在提示它們可能是ERs的直接靶點[ 19]。同時，雌激素可通過快速激活PI3K/Akt信號通路誘導Bcl-2表達[20]。這些途徑都可能是雌激素抑制螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的潛在靶點。

綜上所述，在衰老過程中，雌激素的缺乏會導致C57BL/6J小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡增多，聽力下降，而給予雌激素治療后，可改善這種變化，提示雌激素可通過抑制老年過程耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，發(fā)揮其對聽力的保護作用。而雌激素是通過何種途徑抑制細胞凋亡，仍需進一步研究。