邵一帆， 張安琪， 陳天姣， 李海北， 陳鄭珊， 尹 靜， 楊 棟， 師丹陽， 梁永兵， 程春燕， 譚 蓉， 孫棟良， 李君文， 金 敏

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300000)

重度抑郁癥是一種可遺傳的精神類疾病，其主要的臨床特點(diǎn)為情緒低落、欣快感不足、睡眠改變、食欲改變等。抗抑郁藥物通常分為三環(huán)類抗抑郁藥、四環(huán)類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑、五羥色胺再攝取抑制劑、五羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑及其它類抗抑郁藥物。

5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRIs)類抗抑郁藥物，其與經(jīng)典的三環(huán)類抗抑郁藥和單胺氧化酶抑制劑相比，具有更好的臨床療效、耐受性和安全性，是目前治療抑郁癥的重要藥物[1]。5-羥色胺再攝取抑制劑類抗抑郁藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在很大差異，但其機(jī)制相同，通過抑制神經(jīng)元對5-羥色胺再攝取的機(jī)制發(fā)揮作用，同時也對其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體有一定的結(jié)合能力[2]，引起一定的副作用，其影響主要是腸道紊亂、焦慮、性功能障礙、認(rèn)知障礙以及5-羥色胺綜合征[3]。SSRIs類藥物在體內(nèi)主要通過細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同時也會對多種CYP亞型活性進(jìn)行抑制，從而影響體內(nèi)與CYP代謝相關(guān)的其他藥物的代謝[4]。因此，監(jiān)測其在體內(nèi)的藥物濃度能夠在保持良好療效的同時減少不良反應(yīng)，更能提示潛在的治療風(fēng)險[5]。

目前，生物體內(nèi)血清SSRIs類藥物的定量檢測方法主要以高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法(HPLC-MS)為主[6-8]，檢測方法較為成熟，而針對生物糞便中SSRIs類藥物的含量檢測卻未見報道。本研究以氟西汀、度洛西汀和艾司西酞普蘭等3種臨床常用SSRI類藥物為研究對象，建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測其在糞便中的含量。通過本文研究，不僅有助于開展抗抑郁藥糞便殘留的環(huán)境風(fēng)險評估，也有利于定量檢測腸道內(nèi)抗抑郁藥物的濃度及分布，研究機(jī)體對抗抑郁藥的吸收和代謝。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

乙腈、正己烷、異丙醇(乙腈為HPLC純，其余為分析純，購置于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，度洛西汀(Duloxetine)標(biāo)準(zhǔn)品、艾斯西酞普蘭(Escitalopram)標(biāo)準(zhǔn)品和氟西汀(Fluoxetine)標(biāo)準(zhǔn)品為化學(xué)對照品(中國藥品生物制品檢定所)。度洛西汀、艾斯西酞普蘭、氟西汀藥物(灌胃用，北京百靈威科技有限公司)

1.2 儀器

Agilent6410B高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子(ESI)源，MassHunter工作站(美國Agilent公司)；XW-80A漩渦振蕩器(上海滬西分析儀器廠)；vcx 750手持式超聲波細(xì)胞破碎儀(美國Sonics公司，功率750W)；Universal 320R高速離心機(jī)(德國Hettich公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Milipore公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡SPF級成年雄性C57BL/6N小鼠12只，體重20±2mg，購自北京維通利華動物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所SPF級屏障環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)過程由本單位實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審查通過(IACUC of AMMS-04-2020-027)。實(shí)驗(yàn)動物自由飲水和進(jìn)食，晝夜節(jié)律12 h。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流動相A為超純水，流動相B為乙腈，流速0.2 ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量5 μl。梯度洗脫程序見表1。

Tab. 1 Gradient elution procedure for HLPC

1.5 質(zhì)譜條件

通過正離子監(jiān)測模式(ESI+)，對度洛西汀、氟西汀、艾斯西酞普蘭分別進(jìn)行監(jiān)測(參數(shù)見表2)。ESI+模式的毛細(xì)管電壓: 4.0 kV，干燥氣溫度: 350℃，干燥氣流量：10L/min，碰撞室氮?dú)鈮毫? 0.004Pa，霧化氣壓力40 psi，檢測模式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，三種標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖見圖1。

Tab. 2 MS Parameters of SSRI Drugs

Fig. 1 MRM chromatograms of 3 drugs standard in the feces matrix

1.6 樣品的前處理

精確稱量100 mg小鼠糞便并加入1 ml去離子水后，用手持式超聲波細(xì)胞破碎儀(輸出功率80 W)均質(zhì)1 min；加入3 ml正己烷-異戊醇，旋轉(zhuǎn)震蕩30 s后，用手持式超聲波細(xì)胞破碎儀繼續(xù)均質(zhì)1 min；9 000 r/min離心10 min，吸取上層有機(jī)層至5 ml離心管內(nèi)；30℃下使用氮?dú)膺M(jìn)行吹干后，加入1 ml乙腈復(fù)溶，超聲1 min，旋轉(zhuǎn)震蕩30 s，加入舍曲林(內(nèi)標(biāo))使其終濃度為10 μg/L；0.22 μm濾膜過濾后，樣品待測。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取適量度洛西汀、氟西汀、艾斯西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)溶液并轉(zhuǎn)移至10.0 ml容量瓶中，用乙腈稀釋至終濃度分別為1 mg/L、400 mg/L、100 mg/L，于4℃冰箱避光保存。將內(nèi)標(biāo)舍曲林標(biāo)準(zhǔn)品采用同上方法稀釋至1 mg/L備用。

稱取100 mg空白糞便(未進(jìn)食抗抑郁藥物)，按照1.4所述方法處理后，得到糞便基質(zhì)空白溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)液逐級稀釋成(以度洛西汀濃度計) 1 000 μg/L、500 μg/L、250 μg/L、100 μg/L、50 μg/L系列溶液后，在各溶液中加入終濃度為10 μg/L的內(nèi)標(biāo)舍曲林，充分混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，利用HPLC-MS法進(jìn)行藥物濃度測定。以混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(y)對各組分濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 回收率與精密度測定

稱取100 mg空白糞便樣品并加入不同濃度的度洛西汀、氟西汀或艾斯西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)溶液，震蕩30 min，使藥物與空白糞便樣品充分混合后，使用萃取劑處理樣品并進(jìn)行藥物檢測。其中，回收率為HPLC-MS法檢測出的藥物濃度與實(shí)際加標(biāo)藥物濃度比值(%)，精密度為采用HPLC-MS法測定空白糞便加標(biāo)樣品5次后，獲得的平行數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.9 實(shí)際糞便樣品測定

將12只C57BL/6N小鼠隨機(jī)分為西酞普蘭組、氟西汀組、度洛西汀組、對照組四組，參照臨床用藥劑量，每日分別給予艾斯西酞普蘭(10 mg/kg)、氟西汀(20 mg/kg)、度洛西汀(20 mg/kg)、生理鹽水進(jìn)行灌胃，并于第28日收集糞便進(jìn)行藥物濃度檢測。

2 結(jié)果

2.1 流動相的選擇

分別使用超純水-乙腈、1%甲酸水溶液-乙腈作為高效液相色譜流動相，觀察它們對各種藥物的分離效果。結(jié)果表明，1%甲酸水溶液--乙腈作為流動相時，各組分藥物的保留時間為4～6 min，且3種藥物保留時間間隔<0.3 min，無法充分分離；但以超純水-乙腈作為流動相時，各組分藥物的保留時間為12～14 min，且各藥物組分充分分離。因此，本研究選用超純水-乙腈為流動相。

2.2 樣品預(yù)處理的優(yōu)化

對于樣品預(yù)處理，我們比較了乙腈、正己烷-異丙醇(95∶5，v/v)作為預(yù)處理萃取劑的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，乙腈作為萃取劑時，對艾斯西酞普蘭、氟西汀、度洛西汀的平均回收率分別為75.9%、 57.8%、49.8%，而采用正己烷-異丙醇(95∶5，v/v)混合液作為萃取劑時，三者的平均回收率分別為 94.0%、82.4%、79.9%，與前者相比，回收率有所提高，因此，本研究選擇正己烷-異丙醇混合液作為樣品預(yù)處理萃取劑。

2.3 線性關(guān)系、檢出限與定量限

在對應(yīng)的線性范圍內(nèi)，艾斯西酞普蘭、氟西汀、度洛西汀三種藥物的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.9950、0.9999、0.9985，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。在空白糞便基質(zhì)中添加低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法進(jìn)行測定，以定量離子對3倍信噪比(S/N)的響應(yīng)值對應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)液濃度定為檢出限(LOD)，艾斯西酞普蘭、氟西汀、度洛西汀三種藥物的檢出限分別為0.001 μg/g、1 μg/g、0.1 μg/g。以定量離子對10倍信噪比的響應(yīng)值對應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)液濃度定為定量限(LOQ)，三者定量限分別為0.005 μg/g、2 μg/g、0.5 μg/g(表3)。

Tab. 3 Linear ranges, calibration equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) for 3 SSRI drugs in feces

2.4 方法的回收率與精密度

向空白糞便樣品中加入高、中、低三種已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按照建立的方法，對糞便樣品分別平行測定5次。結(jié)果表明(表4)，建立的HPLC-MS法對糞便中艾斯西酞普蘭的回收率為84.9%～ 116.5%，RSD為2.80%～6.90%，對氟西汀回收率為61.6%～82.4%，RSD為3.27%～5.36%，對度洛西汀回收率為72.7%～83.1%，RSD為2.82%～12.9%。

Tab. 4 Rcoveries and RSDs of 3 SSRI Drugs in feces

2.5 實(shí)際糞便樣品的測定

西酞普蘭組小鼠糞便的藥物含量為0.025± 0.003 μg/g，氟西汀組小鼠糞便的藥物含量為 12.04±1.07 μg/g，度洛西汀組小鼠糞便的藥物含量為 3.44±1.37 μg/g，而生理鹽水組未檢出上述3種藥物。

3 討論

應(yīng)用于SSRIs類藥物的定量檢測方法主要以HPLC或HPLC-MS方法為主[6-8]，其中液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法因其高靈敏度和高選擇性已經(jīng)成為藥物定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜雖然也能夠進(jìn)行SSRIs類藥物的檢測[9, 10]，但由于大部分藥物及其代謝產(chǎn)物的極性較大，不能直接用氣相色譜法進(jìn)行分析，相對于液相色譜，需要在檢測之前對藥物進(jìn)行衍生化，因此，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測SSRIs類藥物具有一定局限性。

隨著HPLC-MS檢測SSRIs類藥物濃度方法增多，利用該方法對[11]生物體內(nèi)藥物含量[12]檢測已經(jīng)趨近成熟，但以上技術(shù)主要以血漿、尿液等成分較為單一的介質(zhì)為檢測對象。藥物在體內(nèi)主要經(jīng)過肝臟代謝，代謝產(chǎn)物經(jīng)腎臟排出，而未經(jīng)吸收的藥物則主要經(jīng)腸道由糞便排出。由于腸道菌群與人類宿主健康關(guān)系密切，而藥物有可能破壞腸道菌群所處腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡，從而引發(fā)代謝性疾病[13]，同時，部分SSRIs類藥物也具有促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生抗生素多重耐藥性的特點(diǎn)[14]，因此檢測糞便中藥物的含量被越來越多的人所重視。同時，糞便中含有大量的食物殘渣和腸道微生物[15]，其基質(zhì)的復(fù)雜性大大增加了樣品預(yù)處理難度和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。曾橋等[16]利用HPLC-MS建立了糞便中殘留物的分析方法，實(shí)現(xiàn)對多種抗生素含量進(jìn)行檢測，戚婧等[17]利用HPLC-MS對糞便中黃連堿的藥物含量進(jìn)行定量檢測。然而目前，針對生物糞便中的SSRIs類藥物含量檢測卻未見報道。

本文通過優(yōu)化糞便樣品預(yù)處理過程，建立了能夠檢測糞便三種抗抑郁藥物(艾斯西酞普蘭、氟西汀、度洛西汀)的HPLC-MS方法，該方法采用手持式超聲波細(xì)胞破碎儀預(yù)處理方法減少糞便基質(zhì)干擾[18]，能夠同時檢測三種抗抑郁藥物含量，而且方法簡單、準(zhǔn)確，藥物回收率高。該技術(shù)將為今后開展抗抑郁藥糞便殘留的環(huán)境風(fēng)險評估提供技術(shù)儲備，更為開展機(jī)體對抗抑郁藥的吸收和代謝研究奠定基礎(chǔ)。