呂紫嫣, 張肖艷, 陳 弘, 蔣盼若, 陳佳玉

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

SmacN7作為體內(nèi)促凋亡蛋白Smac(second mitochondria-derived activator of caspase)的活性基團，是最小的促凋亡單位，其低表達常導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。已有研究證明Tat-SmacN7通過降低XIAP表達水平以及增加乳腺癌細胞SK-BR-3輻射敏感性促進其凋亡[1]；Tat-SmacN7也可以提高Caspase-3、-8、-9的活性，通過細胞凋亡線粒體途徑增加食管癌細胞株EC109和非小細胞肺癌細胞株NCL-H460的輻射敏感性[2]。此外，Smac類似物Birinapant和P38抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于急性髓細胞白血病的治療；Smac類似物L(fēng)CL161和Fasl聯(lián)合應(yīng)用能促進大部分頭頸部腫瘤細胞株凋亡；Smac類似物JP1584和TRAIL聯(lián)合使用可協(xié)同抑制膽管癌腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在中國逐年增高，死亡率在女性惡性腫瘤中排第一；全球范圍內(nèi)，乳腺癌患者占癌癥病例總數(shù)的25%以及所有與癌癥相關(guān)的女性死亡率的15%[4]。乳腺癌是一種以遺傳因素和環(huán)境因素相互作用為特征的復(fù)雜疾病，已經(jīng)確定的危險因素包括超重、吸煙以及生殖等因素[5]，作為威脅女性健康已久的一種疾病，它的治療從起初的單純手術(shù)切除治療逐漸發(fā)展到手術(shù)與放療、化療結(jié)合的綜合性治療，但是化療藥物常常引起劇烈的全身毒性反應(yīng)并且常常發(fā)生耐藥進而導(dǎo)致治療失敗[6]?，F(xiàn)在由于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的提出，人們漸漸地把目光轉(zhuǎn)向特異性好、作用位點明確、效果好、副作用小的基因治療，這避免了放療和化療對機體正常組織細胞的損害。但SmacN7對乳腺癌細胞MDA-MB-157的作用相關(guān)研究很少，機制尚不明確，本研究旨在探討SmacN7對乳腺癌細胞MDA-MB-157的作用及其作用機制，尋找關(guān)鍵基因，以期為乳腺癌的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞MDA-MB-157為紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗室保存。一抗和酶標(biāo)二抗購于武漢BOSTER Biotech公司；PCR各引物由上海Sangon Biotech公司合成；AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒購于美國BD公司；Cell titer 96?AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay(MTS)試劑盒購于美國Promega公司；LDH試劑盒為上海Roche Applied Science公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、RPMI-1640培養(yǎng)液均源于美國Gibco公司；TRIzol、SuperScript? III First-Strand Synthesis System由美國Invitrogen公司提供；JC-1、hoechst 33342、BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA裂解液(強)購于上海Beyotime公司。4周齡雄性BALB/C小鼠購自浙江省實驗動物中心。

1.2 細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞MDA-MB-157培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶傳代1次，實驗均選用對數(shù)生長期細胞。

1.3 細胞增殖實驗

用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整MDA-MB-157細胞密度至5×104cell/ml，以100 μl/well接種于96孔板，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。待細胞貼壁后，加入SmacN7，使其終濃度分別為0，2.5，5，10，20 μmol/L，設(shè)三復(fù)孔，繼續(xù)放入37℃、5% CO2條件中孵育24 h、48 h、72 h。當(dāng)孵育結(jié)束時，在每孔中加入20 μl MTS細胞增殖檢驗試劑，37℃、5% CO2再孵育3 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長的吸光度(OD值)。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡、細胞周期

MDA-MB-157細胞以5×104cells/well接種于6孔板中，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合時，棄培養(yǎng)液，設(shè)三復(fù)孔，分別加入含0， 2.5，5，10，20 μmol/L濃度SmacN7的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別按照FITC/PE、PI染色試劑盒說明書對細胞進行染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡與細胞周期 。

1.5 Hoechst33342染色觀察MDA-MB-157細胞核型

將密度為5×105cell/ml的MDA-MB-157細胞以1 ml/well種植于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合時，棄培養(yǎng)液，設(shè)三復(fù)孔，分別加入含0，10，20 μmol/L濃度SmacN7的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)再培養(yǎng)24 h，用PBS洗滌細胞3次，加入10 ng/ml的hoechst33342試劑1 ml染色15 min，PBS洗滌，滴1滴甘油。以紫外光340 nm波長激發(fā)，倒置熒光顯微鏡下看各組MDA-MB-157細胞經(jīng)不同濃度藥物作用后的凋亡形態(tài)。

1.6 JC-1染色檢測線粒體膜電位

將密度為5×105cell/ml的MDA-MB-157細胞以2 ml/well接種于6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁，棄培養(yǎng)液，設(shè)三復(fù)孔，分別加入含0，2.5，5，10，20 μmol/L濃度SmacN7的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照說明書對細胞進行JC-1染色，染色完成后用胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌細胞3次，流式細胞儀分析線粒體膜電位。

1.7 LDH釋放水平檢測

將MDA-MB-157細胞以每孔2×105cells接種于96孔板，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合，棄培養(yǎng)液，設(shè)三復(fù)孔，分別加入含0，2.5，5，10，20 μmol/L濃度SmacN7的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞和培養(yǎng)上清液，按LDH試劑盒說明書上的方法測定LDH水平。LDH釋放率(%)=培養(yǎng)液LDH含量 /(培養(yǎng)液LDH含量+細胞裂解液LDH含量)×100%

1.8 QPCR檢測細胞內(nèi)各基因mRNA水平

將MDA-MB-157以每孔5×105cells接種于6孔板，待細胞生長至90%融合時，棄培養(yǎng)液，設(shè)三復(fù)孔，分別加入含0，10 μmol/L濃度SmacN7的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，提取總RNA，據(jù)qPCR試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增待測基因及內(nèi)參基因，各基因引物序列見表1。Real time PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循環(huán)；最后72℃ 10 min。凝膠成像儀記錄PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離結(jié)果，用2-△△CT法表示。

Tab. 1 Primer sequences for qPCR

1.9 抑瘤實驗

4周齡雄性BALB/C小鼠在無菌條件下適應(yīng)一周，隨機分成5組，每組20只。取對數(shù)生長期的MDA-MB-157細胞，600 g離心5 min，去上清，PBS清洗，重復(fù)上述操作2次，用生理鹽水調(diào)整細胞濃度至1 × 107cells/ml，對BALB/C小鼠進行腹股溝注射，每只0.1 ml,于細胞接種兩天后皮下分別注射0、1、5、25、125 mg/kg劑量的SmacN7，兩天1次，于首次SmacN7注射后的第20日取10只小鼠的瘤組織并稱重。剩余小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，記錄其生存期。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SmacN7對MDA-MB-157細胞增殖的影響

細胞增殖活性測定結(jié)果如表2所示，SmacN7對乳腺癌細胞MDA-MB-157的增殖有顯著的抑制作用(P<0.01)。

Tab. 2 Effects of SmacN7 on the proliferation activity of MDA-MB-157 cells (n=3)

2.2 SmacN7對MDA-MB-157細胞凋亡與細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如表3所示，MDA-MB-157細胞經(jīng)2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的SmacN7作用后，凋亡率顯著增加(P< 0.01)；Sub-G1期細胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)，提示SmacN7可影響MDA-MB-157細胞的細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡。

Tab. 3 The apoptosis results detected by flow cytometry(%, n=3)

2.3 Hoechst33342染色觀察MDA-MB-157細胞凋亡

結(jié)果如圖1所示，0 μmol/L劑量組MDA-MB-157細胞核呈圓形，邊緣光滑整齊，淡藍色；染色質(zhì)均質(zhì)淡染。而乳腺癌細胞MDA-MB-157經(jīng)10 μmol/L及20 μmol/L的SmacN7作用24 h后，細胞數(shù)量減少，細胞核固縮、碎裂，出現(xiàn)典型的凋亡小體，且20 μmol/L SmacN7組細胞數(shù)量減少及細胞核型改變較10 μmol/L SmacN7組明顯。

Fig. 1 The results of hoechst 33342 staining (×20)

2.4 SmacN7對細胞線粒體膜及LDH釋放的影響

流式分析結(jié)果見表4，MDA-MB-157細胞經(jīng)2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的SmacN7作用后，其線粒體膜電位可顯著降低(P< 0.01)，提示SmacN7促進乳腺癌細胞MDA-MB-157凋亡可能的機制是通過影響其線粒體膜電位；LDH濃度均顯著升高，表示SmacN7對乳腺癌細胞MDA-MB-157具有顯著的細胞毒性 (P<0.01)。

Tab. 4 The results of JC-1 staining of cell mitochondrial membrane potential and LDH release experiment n=3)

2.5 SmacN7影響MDA-MB-157細胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

如表5所示的qPCR結(jié)果表明，應(yīng)用SmacN7后，MDA-MB-157細胞內(nèi)TRAIL、DR4、DR5、p53、PARP-1、Bax、BID、BAK、caspase-3 、caspase-8 、caspase-9基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升(P<0.01)，PI3K、AKT、Ras、mTOR、Bcl-2、Bcl-xL、MCL-1、cIAP-1、cIAP-2基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(P<0.01)。

Tab. 5 The qPCR results (n=3)

2.6 抑瘤實驗

抑瘤實驗結(jié)果如表6所示，與未注射SmacN7組小鼠相比，注射1 mg /kg、5 mg /kg、25 mg /kg、125 mg /kg的SmacN7小鼠腫瘤重量顯著降低(P<0.01)，且其降低與SmacN7劑量呈正相關(guān)。注射0～25 mg /kg的SmacN7小鼠的生存期顯著延長(P< 0.01)，而SmacN7注射量達125 mg /kg時，小鼠生存期縮短。

Tab. 6 The results of tumor suppression and survival time of tumor-bearing mice n=10)

3 討論

近年來，Smac對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響成為熱門研究，一些研究指出Smac在乳腺癌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[7]，其表達下降會導(dǎo)致腫瘤快速增長[8]。Smac相關(guān)制劑已用于血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤的I期臨床試驗，深入研究其與乳腺癌的關(guān)系和機制能進一步為臨床研究提供依據(jù)[7]。本研究表明，SmacN7作用于乳腺癌細胞MDA-MB-157不僅使死亡受體DR4、DR5基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而且上調(diào)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的轉(zhuǎn)錄水平。此前有研究指出，DR4、DR5表達的增加能提高TRAIL在細胞凋亡中的敏感性，后者可通過Caspase-8啟動線粒體信號通路從而引起細胞凋亡[9]。本研究中，SmacN7使TRAIL與死亡受體DR4、DR5結(jié)合，而后死亡受體上的死亡域吸引銜接蛋白并激活Caspase-8從而Caspase-3被激活。Caspase-3可剪切底物PARP-1[10]，而PARP-1是一種重要的DNA修復(fù)酶[11]，其失去活性后乳腺癌細胞MDA-MB-157將發(fā)生凋亡。此外，線粒體中Bcl-2家族成員通過調(diào)節(jié)抑凋蛋白和促凋蛋白在細胞死亡和存活中發(fā)揮重要作用[12，13]，在Caspase-8的作用下，Bid形成有活性的tBid并進入線粒體，使其滲透轉(zhuǎn)運孔PTP開放從而引起線粒體跨膜電位降低、膜通透性增加，釋放大量Cyt-C到細胞質(zhì)中，并與ATP形成復(fù)合體，該復(fù)合體與細胞質(zhì)中的凋亡酶激活因子Apaf-1結(jié)合，由ATP提供能量聚集更多Apaf-1并暴露Apaf-1的N端Caspase募集域使caspase-9聚集于此，形成Cyt-C-Apaf-1-Caspase-9凋亡體[14]，隨后Caspase-3被激活，誘導(dǎo)乳腺癌細胞MDA-MB-157凋亡；同時線粒體膜通透性增加也使Smac/DIABLO釋放入胞質(zhì)[15]，有研究指出Smac上的活性基團SmacN7能與IAP家族(如cIAP1、cIAP2)特異性結(jié)合使IAP家族喪失抑制Caspase-9和Caspase-3的作用[16]，本研究中SmacN7作用于乳腺癌細胞MDA-MB-157使cIAP1、cIAP2基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，從而阻斷IAP家族抑制凋亡的作用，促進乳腺癌細胞MDA-MB-157凋亡。

此外，本研究也顯示SmacN7可以下調(diào)PI3K/AKT途徑中主要蛋白PI3K、AKT、mTOR的基因轉(zhuǎn)錄水平。有研究表明，Ras作為PI3K/AKT途徑的上游通過與生長因子/促分裂原表面的受體結(jié)合而活化[17]，從Ras-GDP轉(zhuǎn)化為Ras-GTP后可激活PI3K，后者催化底物生成第二信使其磷酸化AKT的C’端疏水區(qū)Ser473從而激活A(yù)KT，活化的AKT可直接下調(diào)p53的表達，也可以通過其絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化后激活mTOR[18]，進而調(diào)節(jié)能量代謝、mRNA翻譯以及蛋白質(zhì)的合成，抑制p53的表達[19]。而p53作為抑癌基因通過Bcl家族發(fā)揮促進細胞凋亡的作用[20]，它能與Bax基因啟動子區(qū)結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活促凋蛋白Bax，使其形成同源低聚體以C端為向?qū)度氲骄€粒體外膜；能與MCL-1競爭性結(jié)合Bak形成p53-Bak復(fù)合體使Bak寡聚化，增加線粒體膜的通透性；也能抑制Bcl-2的表達。癌細胞中P53通常由于上游或下游機制的喪失而沉默[21]，本研究中SmacN7作用于乳腺癌細胞MDA-MB-157可通過Ras抑制PI3K/AKT途徑從而使上調(diào)p53基因轉(zhuǎn)錄水平，促進細胞周期停滯和細胞凋亡。

綜上，SmacN7主要通過TRAIL介導(dǎo)的死亡受體途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑抑制乳腺癌細胞MDA-MB-157增殖，誘導(dǎo)其凋亡，對乳腺癌有一定的治療作用，為臨床乳腺癌的治療提供了實驗依據(jù)。