先丹丹，盧發(fā)強(qiáng)

（大連大學(xué) 附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001）

股骨頭壞死即缺血性骨壞死(Avascular Necrosis of the Femoral Head，AVNFH)，是由于股骨頭的血供受損或者中斷，引發(fā)的骨細(xì)胞及其骨髓成分凋亡，隨后組織進(jìn)行修復(fù)，最終使股骨頭的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至出現(xiàn)塌陷和髖關(guān)節(jié)破壞，從而引發(fā)一連串病理生理改變和臨床表現(xiàn)[1,2]。該病是骨科的常見(jiàn)疾病，美國(guó)有30 萬(wàn)至60 萬(wàn)人患有非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(Non-traumatic Osteonecrosis of the Femoral Head，NONFH)，從20 世紀(jì)90 年代開(kāi)始，美國(guó)平均每年增加1 萬(wàn)至2 萬(wàn)的新病例[3-5]。根據(jù)在2012 年6 月至2013 年8 月選出的代表性樣本中，我國(guó)NONFH的總體患病率是0.725%[6]。按照我國(guó)最新人口調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，15 歲以上人群(包括15 歲)中有800 多萬(wàn)人口患有NONFH[7]。ONFH 可分為創(chuàng)傷性股骨頭壞死和NONFH。前者的病因明確，后者主要包括長(zhǎng)期大量使用激素、長(zhǎng)期飲酒、凝血功能障礙、自身免疫性疾病等[8]。但是ONFH 的發(fā)生機(jī)制目前還未完全明確，各國(guó)學(xué)者提出了多種理論：脂質(zhì)代謝紊亂理論、血管內(nèi)凝血理論、基因多態(tài)性理論、骨內(nèi)壓增高理論、骨質(zhì)疏松理論等[9,10]。由于ONFH的自然進(jìn)程較快，如果不進(jìn)行早期診斷和治療，最終患者需要進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量水平。該病的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、體征及影像學(xué)檢查(X 線、CT、MRI 等)，但X 線、CT 不足以用于早期診斷，MRI 用于早期診斷有較好的靈敏度，但是其價(jià)格昂貴，故較難用于早期篩查，導(dǎo)致ONFH 早期診斷較為困難[11]。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要構(gòu)成部分，是近年來(lái)飛速成長(zhǎng)的一門新技術(shù)，被廣泛用到疾病診斷[12]、藥理學(xué)[13]、營(yíng)養(yǎng)學(xué)[14]、微生物學(xué)[15]、食品科學(xué)[16]等各個(gè)領(lǐng)域，在生命科學(xué)領(lǐng)域中表現(xiàn)出巨大的作用。將代謝組學(xué)用于ONFH 的研究，有利于該病的早期診斷。

一、代謝組學(xué)概念

隨著后基因時(shí)代的到來(lái)，人們對(duì)生命有了更加深刻的認(rèn)識(shí)，研究重點(diǎn)慢慢轉(zhuǎn)移到幾個(gè)組學(xué)(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))上來(lái)，他們共同構(gòu)成了系統(tǒng)生物學(xué)。Nicholson 等[17]認(rèn)為基因以及蛋白質(zhì)組學(xué)忽略了生物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)代謝情況，因此在20 世紀(jì)90 年代末提出了一種基于NMR 的“代謝組學(xué)”技術(shù)，將其定義為“定量測(cè)定由于機(jī)體受到各種病理生理干擾或者遺傳變化而造成的動(dòng)態(tài)代謝反應(yīng)”。后來(lái)常將代謝組學(xué)解釋為通過(guò)檢測(cè)生物體受到內(nèi)外環(huán)境干擾或變化后，其代謝物的種類、量以及規(guī)律發(fā)生改變，從而探索生物體的一門科學(xué)[18]。代謝處于生命調(diào)控的尾端，上游生物的破壞可導(dǎo)致下游一系列代謝物發(fā)生變化，因此，代謝組學(xué)擁有大量的信息，較其他組學(xué)而言，更接近于表型，因此它的最終目標(biāo)是盡可能地全盤解析體內(nèi)的小分子代謝物。該組學(xué)可以分成兩種方法[19,20]，即靶向和非靶向代謝組學(xué)。非靶向是盡可能對(duì)標(biāo)本中所有可能測(cè)到的代謝物進(jìn)行全盤分析，其中包含未知的，為找到新的靶標(biāo)給予機(jī)會(huì)；而靶向代謝組學(xué)旨在對(duì)樣本中某一類或幾類特定代謝物進(jìn)行檢測(cè)分析，這有助于降低后續(xù)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析偽像的可能性。

二、代謝組學(xué)研究方法

代謝組學(xué)的流程包含了標(biāo)本的收集及預(yù)處理、數(shù)據(jù)信息的獲取及預(yù)處理、數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計(jì)分析、標(biāo)志物的鑒別以及對(duì)代謝通路的闡述等[21]。將收集的樣本如血漿、血清、尿液、糞便、唾液、胸腹水、腦脊液、組織等進(jìn)行預(yù)處理，然后運(yùn)用核磁共振(NMR)、液相色譜-質(zhì)譜(LS-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)或高效液相色譜法(HPLC-MS)等[22]技術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行收集，收集完成后不能立刻開(kāi)始模式識(shí)別，需要對(duì)其實(shí)行預(yù)處理，一般包含峰匹配、去噪、峰對(duì)齊、歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化等[23]。該技術(shù)獲得的信息是多量的、繁瑣的，為了充分獲取信息，將對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，主要包括非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法的主成分(PCA)、非線性映射(NLM)和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等[23]。需要注意的是，監(jiān)督模型建立之后需要進(jìn)行模型驗(yàn)證，如置換檢驗(yàn)、交叉驗(yàn)證。其中常用的數(shù)據(jù)處理軟件包括SIMCA-P、Sieve、MetaboAnalyst、MarkerLynx、R 軟件等[24-28]。根據(jù)上述分析，可以結(jié)合fold change 值、VIP 值、P 值等來(lái)篩選生物標(biāo)志物。將篩選出的標(biāo)志物進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，對(duì)其進(jìn)行鑒定，常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、MassBank (https://massbank.eu/)、LIPID MAPS(http://www.lipidmaps.org/data/structure/)、NIST (http://www.nist.gov/srd/nistl.htm)、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）等[29-34]，同時(shí)將所找到的標(biāo)志物進(jìn)行代謝途徑分析，從而探索疾病的發(fā)病機(jī)制。

三、ONFH 的代謝組學(xué)研究

隨著組學(xué)技術(shù)的日新月異，代謝組學(xué)在臨床上也得到廣泛應(yīng)用。很多專家利用該技術(shù)對(duì)ONFH 樣本（血漿、尿液或骨組織等）進(jìn)行分析。目前，代謝組學(xué)在ONFH 領(lǐng)域的探索主要涉及生物標(biāo)志物的鑒定、代謝途徑的認(rèn)識(shí)等方面。雖然代謝組學(xué)在ONFH 領(lǐng)域已有一定的發(fā)展，但是，相關(guān)研究仍然面對(duì)很多的困難及挑戰(zhàn)。

（一）ONFH 的潛在生物標(biāo)志物

生物標(biāo)志物的鑒定和代謝途徑的分析具有協(xié)助疾病診斷及治療，了解預(yù)后和探討發(fā)病機(jī)制的潛力。高四川等[35]研究發(fā)現(xiàn)并鑒定出28 種差異性代謝物質(zhì)，同時(shí)篩選出三種潛在診斷性生物標(biāo)志物。Yang G 等[36]篩選出硫酸鹽，尿素，脫氧膽酸和PE[14:0/14:1(9Z)]作為ONFH 的生物標(biāo)志物。Zhu WW 等[37]的研究基于UPLC-MS/MS 篩選出四種股骨頭壞死的潛在性生物標(biāo)志物，四者聯(lián)合診斷ONFH 的價(jià)值較高。經(jīng)歸納，將相關(guān)文獻(xiàn)中提到的生物標(biāo)志物歸納總結(jié)于表1[35-38]。ONFH 的生物標(biāo)記物有利于對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷，甚至可以用于對(duì)疾病預(yù)后的評(píng)估，但是目前該研究還居于初級(jí)狀態(tài)，因此還需加大對(duì)它的探索。

表1 潛在的生物標(biāo)志物

保留時(shí)間 代謝物 變化趨勢(shì) 質(zhì)量 P 值5.61 D-精氨酸 ↑ 174.1116 0.000 7.46 L-脯氨酸 ↑ 115.0633 0.000 7.93 L-谷氨酰胺 ↑ 146.0691 0.000 6.89 L-肉堿 ↑ 162.1051 0.000 6.25 肌苷 ↑ 268.08070.000

（二）ONFH 的代謝途徑

1 核苷酸代謝和嘌呤代謝

核苷酸是核酸(DNA 和RNA) 的基本結(jié)構(gòu)單位。嘌呤分解代謝過(guò)程中，次黃嘌呤最終將分解為尿酸，在這個(gè)過(guò)程中會(huì)形成氧自由基，具有組織損傷作用[39]。肌苷是腺苷的分解產(chǎn)物，可顯著減少脂質(zhì)過(guò)氧化，并增加了還原型谷胱甘肽(GSH)以及超氧化物歧化酶(SOD)的程度，具有抗炎抗氧化作用[40]。ONFH 患者次黃嘌呤水平降低[35]，肌苷水平升高[38]，這些研究可能說(shuō)明了ONFH 的發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。

2 氨基酸代謝

甲硫氨酸(蛋氨酸，Met)是體內(nèi)的含硫氨基酸，由于體內(nèi)無(wú)法自動(dòng)合成，需要由食品提供，因此它屬于必需氨基酸。Met 可以轉(zhuǎn)變成其他含硫氨基酸：半胱氨酸以及胱氨酸。在Met 循環(huán)中，它可以在各種酶的協(xié)助下依次形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、同型半胱氨酸(Hcy)、Met。Hcy 主要有兩條代謝途徑，一條是再甲基化途徑：其中轉(zhuǎn)甲基酶的輔酶是VitB12；另一條為轉(zhuǎn)硫途徑，其中以VitB6 為輔酶。因此，Hcy 代謝與VitB12、VitB6 水平密切相關(guān)。Yang J 等[41]發(fā)現(xiàn)Hcy 顯著增加了骨折風(fēng)險(xiǎn)。Narayanan A 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，ONFH 的靶向代謝組學(xué)分析揭示了甲硫氨酸-同型半胱氨酸途徑代謝物的變化，ONFH 樣本中Met、SAM、SAH、Hcy 和腺苷水平顯著提高，VitB12 和VitB6 水平下降，這兩種維生素作為Hcy代謝的輔酶，進(jìn)一步說(shuō)明了股骨頭壞死患者體內(nèi)Hcy 的積累。Yang G 等[36]研究同樣也表明ONFH與半胱氨酸和蛋氨酸代謝有關(guān)，絲氨酸、硫酸鹽和Hcy 在這一途徑中受到影響。Hcy 可以增加氧化應(yīng)激，破壞膠原分子的交聯(lián)，增加晚期糖基化終產(chǎn)物的水平，從而降低骨強(qiáng)度，增加骨吸收[43]。有研究表明[44-46]，Hcy 水平增高可使破骨細(xì)胞活性增加，誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞凋亡。Fitzpatrick 等[47]發(fā)現(xiàn)，靶向破壞小鼠組氨酸脫羧酶(HDC)基因[HDC（-/-）]后，它的破骨細(xì)胞數(shù)目降低，骨形成增長(zhǎng)而骨吸收降低，骨皮層厚度和礦物質(zhì)含量增長(zhǎng)。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)是骨代謝尤其是成骨細(xì)胞形成的重要調(diào)節(jié)劑，研究表示[48]，精氨酸(Arg)可以刺激鼠成骨樣細(xì)胞的IGF-1 和膠原蛋白的形成，通過(guò)增強(qiáng)局部IGF-1 的產(chǎn)生來(lái)影響骨形成。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)對(duì)于骨骼形成非常重要，而缺乏Pyk2(Pyk2-KO)的雌性小鼠則表現(xiàn)出骨含量增長(zhǎng)以及骨骼形成速度加快，而破骨細(xì)胞活性降低[49]。由此可見(jiàn)，氨基酸代謝在ONFH 的病理生理中有著不可替代的影響。

3 脂類代謝

肉堿具有多種作用，它不僅可以促進(jìn)脂肪酸的β 氧化，還可以調(diào)控人體中膽固醇(CHOL)的形成和分布，與此同時(shí)它還可以改變脂蛋白的成分及比例[50]。研究發(fā)現(xiàn)[51]，左旋肉堿(LC)增強(qiáng)了線粒體的活性并改善了成骨樣細(xì)胞的抗氧化能力，同時(shí)LC 增加了Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ，此外，LC 誘導(dǎo)ERK1/2 和AKT 的磷酸化以及成骨細(xì)胞分化的主要激酶，并上調(diào)了成骨相關(guān)基因包括核心結(jié)合蛋白因子2(RUNX2)、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)、骨唾液蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)等，這些都提示了LC 對(duì)成骨因子起著上調(diào)作用。在ONFH 的研究中，發(fā)現(xiàn)肉堿水平升高[37,52]。果糖作為一種單糖，如果過(guò)量攝入果糖可能會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，其中極低密度脂蛋白(VLDL)以及甘油三酯(TG)水平升高[53]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)ONFH 患者果糖代謝水平上調(diào)[35]。甘油磷脂主要包括磷脂酰膽堿(卵磷脂、PC)、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂、PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂、DAG)、磷脂酰肌醇(PI)。破骨細(xì)胞如果融合不良可能會(huì)影響體內(nèi)骨骼的完整性，研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞形成中細(xì)胞融合步驟受PS 調(diào)節(jié)的幾種蛋白質(zhì)活性的控制[54]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是肌醇和PI 中的一種重要激酶，Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)PI3K/Akt 細(xì)胞信號(hào)途徑可以增加成骨細(xì)胞的繁殖，分化以及骨形成[55]。ONFH中甘油磷脂代謝受到顯著干擾[36,37,52]，說(shuō)明甘油磷脂代謝在股骨頭壞死的病理過(guò)程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。于雪峰等[56]利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸代謝發(fā)生異常也是引起ONFH 的緊要原因。由此可見(jiàn)，更好地了解脂質(zhì)代謝變化在ONFH 中的所起的作用，有助于探索疾病的發(fā)病機(jī)制，甚至有可能有助于開(kāi)發(fā)治療該病的新方法。

4 能量代謝

糖酵解途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸后進(jìn)入線粒體，經(jīng)過(guò)氧化脫羧形成乙酰CoA，再經(jīng)過(guò)TCA 循環(huán)被完全氧化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以進(jìn)行自身的更新以及多向分化，它可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等等，其中未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲能主要依靠糖酵解代謝，而MSCs 向成骨細(xì)胞分化過(guò)程主要依靠線粒體氧化磷酸化獲能[57,58]。3-磷酸甘油酸[36,52]、丙酮酸和乳酸[52]水平降低，可能表明ONFH 的能源供應(yīng)受到干擾。3-磷酸甘油酸和丙酮酸水平降低，說(shuō)明了丙酮酸來(lái)到線粒體后經(jīng)過(guò)氧化脫羧后產(chǎn)生的乙酰CoA 減少，導(dǎo)致進(jìn)一步通過(guò)TCA 循環(huán)時(shí)所生成的能量減少。而乳酸以及丙酮酸等還是糖異生過(guò)程中的原材料，他們可以通過(guò)這個(gè)過(guò)程轉(zhuǎn)化為葡萄糖再進(jìn)行糖酵解。這些都說(shuō)明了ONFH 患者糖酵解和TCA 循環(huán)兩個(gè)能量代謝途徑受到了顯著干擾。

代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示了ONFH 患者的多個(gè)代謝途徑受到了明顯的干擾，主要有核苷酸、嘌呤、氨基酸、脂質(zhì)、能量代謝等多個(gè)途徑。但是目前對(duì)代謝途徑的研究還處于初步階段，還需要進(jìn)一步加大對(duì)ONFH 患者的代謝途徑變化的研究，從而探索ONFH 的發(fā)病機(jī)制，并積極尋找治療ONFH 的新靶點(diǎn)。

四、總結(jié)和展望

代謝組學(xué)是一種新興的組學(xué)方法，它不僅彌補(bǔ)了其他組學(xué)在研究中的不足，還在過(guò)去的幾十年里，在各個(gè)領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)展。由于分析技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，代謝組學(xué)被廣泛作為醫(yī)學(xué)研究中的新興診斷、探索疾病發(fā)病機(jī)制、評(píng)估預(yù)后情況以及治療新靶點(diǎn)的工具。但是由于代謝組學(xué)的起步較晚，從整體水平上看，代謝組學(xué)現(xiàn)在還處在成長(zhǎng)的初步階段。由于樣品的復(fù)雜、儀器的繁瑣、沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)庫(kù)等使代謝組學(xué)面臨著重大的困難和挑戰(zhàn)。ONFH 是骨科的常見(jiàn)病、多發(fā)病和難治性疾病，其病因以及發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，如不早期診斷和治療，病人將走向髖關(guān)節(jié)置換這一步，這嚴(yán)重降低了患者及其家人的生活質(zhì)量水平。目前，代謝組學(xué)在股骨頭壞死領(lǐng)域取得了一定的研究進(jìn)展，特別是在股骨頭壞死的診斷性生物標(biāo)志物及代謝途徑等方面，這讓我們看到了代謝組學(xué)在ONFH 領(lǐng)域具有重大的前途。但是，就目前研究情況來(lái)看，相關(guān)研究報(bào)道所涉及的生物標(biāo)志物不同或生物標(biāo)志物變化趨勢(shì)與疾病的發(fā)生關(guān)系相反等，這可能與研究對(duì)象分期、代償或失代償、檢測(cè)樣本與技術(shù)、數(shù)據(jù)庫(kù)等具有差異有關(guān)，這也是研究股骨頭壞死面臨的挑戰(zhàn)。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)對(duì)疾病的探索會(huì)有更深一步的發(fā)展，從而科學(xué)合理地保障人們的生命健康安全。