陳榮真，張志勇，劉麗云，張夢思，趙猛，鄭曉娟

（唐山市工人醫(yī)院 病理科，河北 唐山）

0 引言

結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率逐年升高[1]。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率年均上升 3%～4%[2]，嚴(yán)重危害我國居民的健康。染色體不穩(wěn)定（CIN）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）和CpG島表型甲基化（CIMP）是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[3]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）是指腫瘤組織 DNA 復(fù)制過程中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象，而錯配修復(fù)蛋白（mismatch repair protein， MMRP）是導(dǎo)致 MSI 發(fā)生的主要原因。此外，由MMR蛋白功能缺陷引起的 MSI 受到廣大臨床工作者的重視[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白功能缺陷引起的高度MSI在指導(dǎo)治療及評估預(yù)后中意義重大[7-8]。臨床工作中，以腫瘤腸壁浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為判斷標(biāo)準(zhǔn)的 TNM 分期系統(tǒng)與結(jié)直腸癌臨床治療方案的制訂密切相關(guān)。本研究旨在分析結(jié)直腸癌患者 MMR 蛋白表達(dá)和MSI與腫瘤TNM分期的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料來源

回顧性分析2004年1月至2018年12月在唐山市工人醫(yī)院收治的具有完整臨床病理資 料的結(jié)直腸癌患者758例。其中，男性456例，女性302例；年齡為31-94歲，中位年齡65歲。

1.2 方法

收集結(jié)直腸癌患者的術(shù)后標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法檢測MMR蛋白表達(dá)。 術(shù)中獲取的結(jié)直腸癌組織均經(jīng)3.7%甲醛液固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚3-4μm，行常規(guī)HE及免疫組織化學(xué)Envision法染色，抗MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 鼠單克隆抗體購自羅氏生物科技公司。按產(chǎn)品說明步驟進(jìn)行染色。每張切片內(nèi)的非腫瘤腸上皮黏膜細(xì)胞明確的核著色陽性為內(nèi)對照。MMR蛋白在腫瘤細(xì)胞核明確著色表達(dá)判定為陽性，任何比率腫瘤細(xì)胞的陽性均視為陽性[9]，與核染色強(qiáng)弱以及陽性細(xì)胞彌漫或局灶分布無關(guān)。細(xì)胞核不著色判斷為陰性。按第7版美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）標(biāo)準(zhǔn)對所有患者行TNM分期并分組，分析不同性別、年齡及分期組MMR蛋白表達(dá)和MSI情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR 蛋白表達(dá)情況

758例標(biāo)本中，63例（8.3%）MMR 蛋白表達(dá)缺失。其中，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 單獨(dú)缺失分別有3、3、6、8 例，MLH1聯(lián)合PMS2缺失27例，MSH2聯(lián)合PMS2缺失6例，MLH1聯(lián)合MSH6缺失3例，MLH1、MSH6、PMS2共同缺失3例。

2.2 MMR蛋白表達(dá)與 TNM 分期相關(guān)性的單因素分析結(jié)果

年齡≥60歲與＜60歲患者間PMS2缺失率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；T3期亞組MSH2缺失率與其他T分期亞組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；N1期亞組 MSH2缺失率與其他N分期亞組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TNM分期Ⅱ期、Ⅲ期亞組MSH2缺失率與其他TNM分期亞組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）；TNM分期Ⅲ期亞組MSH6缺失率與其他TNM分期亞組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。 T2期亞組、T3期亞組及TNM分期Ⅰ期亞組MSI陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）（表 1）。

表1 結(jié)直腸癌患者錯配修復(fù)蛋白表達(dá)及微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）與臨床病理特征相關(guān)性的單因素分析結(jié)果[例（%）]

續(xù)表1

2.3 MSI 與 TNM 分期相關(guān)性的單因素分析結(jié)果

T2期亞組、T3期亞組及TNM分期Ⅰ期亞組MSI陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）（表 1）。

3 討論

隨著腔鏡技術(shù)和新輔助治療在臨床的廣泛開展，結(jié)直腸癌的治療有很大改善[10]。同時，循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展為結(jié)直腸癌患者提供了更加精準(zhǔn)的診療。Koopman M建議臨床Ⅲ期及以上患者需進(jìn)行輔助治療[11]，因此準(zhǔn)確的臨床分期尤為重要。AJCC和國際抗癌聯(lián)盟（UICC）提出了TNM分期系統(tǒng)， 雖然在某些方面仍有爭議[12]，但在結(jié)直腸癌的診療及預(yù)后方面仍有較大作用。

微衛(wèi)星又稱短串聯(lián)重復(fù)序列，在復(fù)制過程中長度通常保持不變。其序列隨機(jī)分布于人類基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，這種重復(fù)的特性使其在復(fù)制過程中容易出現(xiàn)錯配。正常生理?xiàng)l件下，DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)可以及時發(fā)現(xiàn)并糾正微衛(wèi)星序列復(fù)制產(chǎn)生的錯誤，進(jìn)而維持整個基因組的穩(wěn)定；當(dāng)DNA復(fù)制過程發(fā)生錯誤，MMR蛋白因?yàn)楣δ苋毕莶荒軠?zhǔn)確識別、修復(fù)錯配的DNA時，導(dǎo)致一個或多個重復(fù)堿基的插入或缺失，進(jìn)而引起MSI[13]。目前主要利用兩種方法檢測MSI：一是通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測樣本中微衛(wèi)星位點(diǎn)序列，并與正常DNA 序列進(jìn)行比對分析，進(jìn)而判別MSI狀態(tài)；二是通過免疫組織化學(xué)法檢測樣本中錯配修復(fù)蛋白表達(dá)情況。因免疫組織化學(xué)法相比聚合酶鏈反應(yīng)有著易操作、成本低等優(yōu)勢[14]，臨床上常用免疫組織化學(xué)法檢測MMR蛋白以對腫瘤MSI狀態(tài)進(jìn)行篩選[15]。研究表明，檢測腫瘤MSI對結(jié)直腸癌的診療和判斷預(yù)后有重要意義。高水平MSI （MSI-H）結(jié)直腸癌與MSS和 低水平MSH（MSI-L）結(jié)直腸癌相比，有獨(dú)特的生物學(xué)特征，MSI-H 結(jié)腸癌好發(fā)于右半結(jié)腸、多原發(fā)癌、傾向于低分化及黏液腺癌、有較低的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[16]。Sargent DJ等認(rèn)為，MSI-H是腫瘤預(yù)后良好的標(biāo)志[17]。Zaanan 等[18]研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ期MSI-H結(jié)直腸癌患者采用FOLFOX方案輔助化療，無進(jìn)展生存時間顯著延長。Liang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H 結(jié)直腸癌Ⅳ期患者與MSI-L、MSS的Ⅳ期患者相比，以5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療更能帶來生存獲益。因此，鑒于MSI檢測對結(jié)直腸癌的診療有重要的指向性，2016版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南推薦所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均進(jìn)行MMR蛋白及MSI檢測[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率為8.3%，與以往報道相似；結(jié)直腸癌MMR蛋白表達(dá)缺失和MSI與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)；結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)缺失和MSI與患者發(fā)病年齡有關(guān)。因此，MMR蛋白及MSI的檢測可以作為判定結(jié)直腸癌患者TNM分期的客觀參考指標(biāo)，進(jìn)而判定患者術(shù)后是否需要輔助放化療。同時，檢測腫瘤MMR蛋白表達(dá)及MSI也可作為指導(dǎo)臨床治療的重要依據(jù)。