周蕾, 張彥, 張娟, 吳曉穎, 馬興華

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266101; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081)

葉片發(fā)育遵循著一個(gè)基本的模式，葉原基(shoot apical meristem,SAM)從植物地上部分的頂端分生組織周圍區(qū)起始發(fā)育，經(jīng)過一系列細(xì)胞分裂和分化的程序最終發(fā)育為成熟的葉片[1]。葉原基最初進(jìn)行細(xì)胞分裂，產(chǎn)生大小一致且體積較小的新細(xì)胞。隨后，細(xì)胞分裂逐漸減弱至停止，葉片的繼續(xù)發(fā)育主要靠個(gè)體細(xì)胞的增大，最終形成完整的葉片。葉片大小的突變通過影響細(xì)胞分裂與擴(kuò)展這兩個(gè)過程，進(jìn)而影響到細(xì)胞的數(shù)目與體積的大小。龍海馨[2]通過對(duì)水稻窄葉突變體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)窄葉突變體的細(xì)胞大小變化不明顯，細(xì)胞數(shù)目顯著減少，從而確定葉片變窄主要是由于細(xì)胞數(shù)量減少造成的。Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥atcsp3突變株植株整體較小，蓮座葉發(fā)育不全呈圓形且葉片卷曲，柵欄組織葉肉細(xì)胞在突變體葉片中體積較小。在an3或ant突變體中，細(xì)胞數(shù)量的減少與細(xì)胞大小的增加有關(guān)，但葉面積最終還是會(huì)呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)[4-5]。除此之外，AtGRF1和AtGRF2的過表達(dá)導(dǎo)致葉片和子葉變大，AtGRF1-AtGRF3的三插入缺失突變體葉片和子葉較小[6]。DELLA蛋白降低了細(xì)胞增殖速率，減慢細(xì)胞的擴(kuò)展速度，抑制植物的生長發(fā)育[7]。AtRPT2a突變體表現(xiàn)出一種因細(xì)胞體積增加而導(dǎo)致葉片增大的特殊表型[1,8]。

煙草是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，以收獲葉片為目的，葉片的大小與煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。煙葉的大小受多種農(nóng)藝措施的調(diào)控，付仲毅[9]研究發(fā)現(xiàn)，滴灌更能促進(jìn)煙葉長和寬的生長；劉繼坤[10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著種植密度的降低，煙葉的長、寬增加；秦燚鶴等[11]研究發(fā)現(xiàn)，增施腐熟秸稈處理后，煙葉面積增加；楊興有[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著光強(qiáng)減弱，上部煙葉與中部煙葉的長寬變化呈拋物線變化趨勢(shì)。上述研究主要集中于農(nóng)藝措施對(duì)煙葉大小的影響研究，關(guān)于煙草葉片大小差異的機(jī)理研究尚少。本研究以煙草品種‘紅花大金元’的兩個(gè)葉形突變體為試驗(yàn)材料，通過葉片的形態(tài)指標(biāo)和解剖學(xué)特征比較以及關(guān)鍵基因表達(dá)量的分析，初步解析煙草葉片大小差異的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為煙草(NicotianatabacumL.)品種‘紅花大金元’及其兩個(gè)突變體(突變體1和突變體2)，種子均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所中國煙草突變資源生物信息庫和利用平臺(tái)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1植株培養(yǎng) 按照煙草托盤育苗法進(jìn)行育苗操作和管理，育苗基質(zhì)(泥炭和蛭石比例為1∶1)經(jīng)120 ℃滅菌20 min后裝盤。將煙草種子均勻播撒于播種盤中，3周后選擇長勢(shì)均勻一致的幼苗移栽到花盆中，規(guī)格為10 cm×10 cm(底面直徑×高)，置于溫度為23～28 ℃，相對(duì)濕度為60%～70%的溫室中培養(yǎng)120 d。

1.2.2煙葉生長指標(biāo)測(cè)定 取中部全展葉，用卷尺人工測(cè)量葉長、葉寬，以葉長/葉寬表示葉形指數(shù)(leaf shape index)。葉面積計(jì)算參考肖強(qiáng)等[13]的方法。后將煙葉置于烘箱中105 ℃殺青15 min，然后70 ℃下烘干至恒重，稱取干重，計(jì)算比葉重(leaf mass per area, LMA)[14]。

LMA=葉干重/葉面積

1.2.3葉形態(tài)解剖學(xué)特征比較 取中部全展葉，用蒸餾水清洗干凈。在葉片中部，距離葉脈0.5 cm處切取面積1 cm2的組織，參考Tsukaya等[15]的方法，在 FAA 固定液(體積百分比5%醋酸，體積百分比45%乙醇和體積百分比5%福爾馬林)中固定，然后經(jīng)酒精逐級(jí)脫水，將預(yù)埋材料切割成2 μm厚的切片，用甲苯胺藍(lán)、藏紅花素以及橙色G進(jìn)行染色，中性樹膠封片，利用光學(xué)顯微鏡(NIKON Eclipse Ci，上海衡浩儀器有限公司)觀察海綿層的縱切面以及葉片的橫切面。用鑷子撕取葉片下表皮并制成臨時(shí)裝片，用光學(xué)顯微鏡(Leica DMC 2900，上海徠卡儀器有限公司)觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞形態(tài)指標(biāo)采用Image J 1.52r軟件進(jìn)行測(cè)量，細(xì)胞數(shù)目估算參考黃淦等[16]方法。

1.2.4RNA提取和qRT-PCR 為了驗(yàn)證與葉片大小相關(guān)基因在兩個(gè)突變體以及野生型葉片中的表達(dá)情況，參考已發(fā)表的擬南芥、番茄和馬鈴薯的葉片發(fā)育基因，在茄科基因組數(shù)據(jù)庫(Sol Genomics Network：http://www.sgn.cornell.edu)以及美國國立生物技術(shù)中心(NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中搜索，篩選得到12個(gè)與葉片形態(tài)大小有關(guān)的基因，用于qRT-PCR分析，這些基因主要通過影響細(xì)胞的數(shù)量和體積大小進(jìn)而控制葉片的大小，詳細(xì)基因信息見表1。于苗期(七葉期)取新生葉位的葉片，迅速置于液氮，-80 ℃保存，用RNA提取試劑盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa公司)提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和完整性，利用反轉(zhuǎn)錄酶Primescript RT reagent Kit(TaKaRa公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以Actin為內(nèi)參基因[17]，引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成，序列見表2。定量體系為 20 μL，其中包含DNA 1 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，DEPC水8.2 μL，3次重復(fù)。采用 2-△△Ct法[18]進(jìn)行基因相對(duì)定量分析。

表1 基因信息Table 1 Gene information

表2 引物信息Table 2 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2018和SAS 9.4進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉形突變體的生長指標(biāo)

不同葉形突變體的形態(tài)測(cè)量結(jié)果(表3)顯示，突變體1的葉長、葉寬顯著低于野生型，突變體2的葉長顯著低于野生型，葉寬與野生型無顯著差異。突變體1與野生型的葉形指數(shù)和葉面積均存在顯著差異，突變體1的葉形指數(shù)為野生型的2.52倍，葉面積為野生型的10.12%，該突變體最顯著的特征是葉寬生長受到抑制，其葉寬僅為野生型的25.88%。突變體2的葉形指數(shù)與野生型無顯著差異，葉面積卻顯著小于野生型，主要是葉長生長受到抑制，突變體2的葉長為野生型的78.82%。此外，突變體與野生型的葉片鮮重和干重也存在差異。突變體1與突變體2的單葉鮮重顯著小于野生型，但突變體2的葉片干重與野生型無顯著差異。突變體1的比葉重為野生型的1.91倍，突變體2的比葉重為野生型的1.35倍，說明突變體1與突變體2葉片較厚。

表3 突變體與野生型葉片形態(tài)指標(biāo)Table 3 Leaf morphological indexes of wild and mutants of tobacoo plants

2.2 葉形突變體的葉片解剖結(jié)構(gòu)比較

不同材料的葉片解剖結(jié)構(gòu)結(jié)果(圖1A-I)可見，突變體1葉片下表皮細(xì)胞的褶皺稍弱，細(xì)胞形狀整體較規(guī)則；突變體2下表皮細(xì)胞的褶皺較強(qiáng)，細(xì)胞形狀不規(guī)則。與野生型相比，突變體1的海綿組織細(xì)胞排布更為緊湊，而突變體2的海綿組織細(xì)胞排布更為疏松。突變體1與野生型的葉片柵欄組織細(xì)胞大小基本一致，且排列整齊，突變體2的柵欄組織細(xì)胞排布相對(duì)雜亂。

注：A：野生型下表皮縱切面；B：突變體1下表皮縱切面；C：突變體2下表皮縱切面；D：野生型海綿層縱切面；E：突變體1海綿層縱切面；F：突變體2海綿層縱切面；G：野生型葉片橫切面；H：突變體1葉片橫切面；I：突變體2葉片橫切面；J：0.067 5 mm2視野下海綿組織的細(xì)胞數(shù)目；K：海綿組織的估算細(xì)胞總數(shù)。柱子上的不同小寫字母表示不同材料間差異在P<0.05水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: A: Paradermal sections of lower epidermis of wild; B: Paradermal sections of lower epidermis of mutant 1; C: Paradermal sections of lower epidermis of mutant 2; D: Paradermal sections of spongy layer of wild; E: Paradermal sections of spongy layer of mutant 1; F: Paradermal sections of spongy layer of mutant 2; G: Cross section of the leaf lamina of wild; H: Cross section of the leaf lamina of mutant 1; I: Cross section of the leaf lamina of mutant 2; J: Cell amount in 0.067 5 mm2 area; K: Estimated cell amount. Different lowercase letters on the top of column indicate statistically significant differences between different materials at P<0.05 level.圖1 野生型與突變體葉片解剖結(jié)構(gòu)Fig.1 Leaf anatomy of wild and mutants of tobacco plants

為進(jìn)一步明確突變體1與突變體2海綿組織細(xì)胞出現(xiàn)差異的原因，統(tǒng)計(jì)了相同視野大小中海綿組織細(xì)胞的數(shù)目，結(jié)果(圖1J)顯示，相同部位相同面積情況下，突變體2葉片的細(xì)胞數(shù)目顯著少于野生型，突變體1的細(xì)胞數(shù)目略高于野生型，但差異不顯著。通常葉片中細(xì)胞數(shù)目的不同可能會(huì)導(dǎo)致葉片大小差異，因此對(duì)葉片中同一層海綿組織的細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行估算，結(jié)果(圖1K)顯示，與野生型相比，突變體1與突變體2葉片中的海綿組織細(xì)胞總數(shù)均顯著減少。

野生型和突變體的不同葉片組織結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表4)顯示，突變體1和突變體2的葉片厚度均顯著大于野生型。突變體1的柵欄組織厚度顯著高于野生型，而海綿組織厚度與野生型沒有顯著差異，因此突變體1葉片較厚主要是由于柵欄組織較厚。突變體2的葉片海綿組織厚度顯著高于野生型，而柵欄組織厚度與野生型沒有顯著差異，因此其葉片較野生型厚，主要是因?yàn)楹＞d組織更厚。突變體1、突變體2與野生型的柵欄組織/海綿組織比值均小于1，其中突變體1的柵欄組織/海綿組織比值顯著高于野生型。與野生型相比，突變體1的海綿組織細(xì)胞直徑較小，突變體2的海綿組織細(xì)胞體積較大。因此，突變體2葉片厚度的增加與海綿組織細(xì)胞體積的增加有關(guān)。

表4 突變體與野生型葉片組織結(jié)構(gòu)比較Table 4 Leaf structure of WT and mutants of tobacco plants

2.3 葉形突變體的基因表達(dá)比較

12個(gè)基因在3個(gè)材料中的表達(dá)量結(jié)果見圖2，可見，突變體1中NtARF2-1、NtDA1、NtTOR1、NtARF10-2、NtEBP1、NtGRF8和NtGRF16共7個(gè)基因的表達(dá)與野生型有較大差異，其中NtEBP1基因表達(dá)量上調(diào)幅度最大，上調(diào)2.22倍；NtGRF8和NtGRF16基因表達(dá)量顯著下調(diào)，表達(dá)量分別為野生型的16.06%和13.07%。突變體2中12個(gè)基因的表達(dá)量與野生型相比均有較大的差異，其中NtTOR1和NtARF10-1表達(dá)量上調(diào)幅度較大，分別上調(diào)3.17倍和2.51倍，NtARF2-1、NtARF2-2、NtDA1、NtGRF8、NtGRF16顯著下調(diào)，其中NtGRF8、NtGRF16的下調(diào)幅度最大。在突變體1和突變體2中，NtTOR1、NtARF10-2和NtEBP1的基因表達(dá)量均顯著高于野生型，NtGRF8和NtGRF16的基因表達(dá)量均顯著低于野生型，表達(dá)量分別為野生型的13.43%和21.68%。NtARF2-1在突變體1中的表達(dá)量顯著上調(diào)，在突變體2中顯著下調(diào)。

注：不同小寫字母表示同一基因在不同材料間差異在P<0.05水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different lowercase letters of the same gene indicate statistically significant differences between different materials at P<0.05 level.圖2 葉發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)特性分析Fig.2 Analysis of expression characteristics of key genes in leaf development

3 討論

葉片是植物進(jìn)行光合作用與呼吸作用的主要器官，煙草葉片大小是影響煙草產(chǎn)量與質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。突變體1與突變體2的葉面積均顯著低于野生型。與野生型相比，突變體1的葉寬顯著減小，突變體2的葉長生長受到抑制。在細(xì)胞水平上，葉片的生長受細(xì)胞增殖與細(xì)胞擴(kuò)張兩個(gè)過程共同調(diào)控，細(xì)胞體積增加后，細(xì)胞數(shù)量隨之下降，反之，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞體積增加[24]。大量研究表明[15,25-26]，細(xì)胞數(shù)量與葉片大小之間存在直接的相關(guān)性，葉片大小生長受到的抑制往往與細(xì)胞數(shù)目的減少有關(guān)。本研究中，通過對(duì)葉片形態(tài)解剖學(xué)特征比較發(fā)現(xiàn)，突變體1與突變體2葉片細(xì)胞總數(shù)與野生型相比顯著降低，這與以往的研究結(jié)果[18]相似。突變體1同一層海綿組織細(xì)胞總數(shù)僅為野生型的10.93%，細(xì)胞體積也顯著低于野生型；突變體2的同一層海綿組織細(xì)胞總數(shù)為野生型的48.12%，細(xì)胞體積顯著高于野生型。因此，與細(xì)胞體積相比，細(xì)胞總數(shù)的減少與突變體1和突變體2的葉形變化關(guān)系更密切。在相同大小視野下，突變體1的細(xì)胞體積顯著低于野生型，細(xì)胞數(shù)目略高于野生型；突變體2的細(xì)胞數(shù)目顯著低于野生型，細(xì)胞體積顯著高于野生型。這種現(xiàn)象與Tsukaya[27]提出的經(jīng)典細(xì)胞決定理論相同。這一理論強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞狀態(tài)和行為之間相互影響，即葉片細(xì)胞數(shù)量和體積相互補(bǔ)償。本研究中，即使細(xì)胞數(shù)量與大小之間出現(xiàn)了相互補(bǔ)償作用，葉片的最終大小仍然受到抑制，并且在突變體1中，這種抑制作用首先體現(xiàn)在中-邊軸，突變體2中這種抑制作用首先體現(xiàn)在莖-頂軸。細(xì)胞數(shù)量與體積的補(bǔ)償作用是否會(huì)對(duì)葉極性發(fā)育產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步探討。

目前，許多葉發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因、小分子 RNA 和生長素等調(diào)控因子被相繼發(fā)現(xiàn)，它們之間復(fù)雜的相互作用也得到初步地闡述。Kim等[6]研究指出，過表達(dá)AtGRF2能夠通過促進(jìn)細(xì)胞體積的增加，進(jìn)而促進(jìn)葉面積的擴(kuò)大。本研究發(fā)現(xiàn)，突變體1的細(xì)胞總數(shù)和體積顯著低于野生型，而且NtGRF8和NtGRF16基因的表達(dá)量顯著低于野生型，說明NtGRF8和NtGRF16基因的表達(dá)量與細(xì)胞體積密切相關(guān)，同時(shí)也可能控制細(xì)胞的數(shù)量。Li等[20]研究表明，AtDA1能夠通過限制細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制葉片面積的增加。本研究中，NtDA1基因的表達(dá)量顯著高于野生型，突變體1的細(xì)胞總數(shù)減少，這與Li等[20]研究結(jié)果相似。Deprost等[21]研究表明，隨著AtTOR表達(dá)量的增加，擬南芥的蓮坐葉葉面積逐漸增加，細(xì)胞大小也相應(yīng)增加。本研究結(jié)果顯示，突變體2的細(xì)胞體積顯著大于野生型，并且NtTOR1和NtTOR2基因的表達(dá)量分別上調(diào)3.17和1.71倍，說明NtTOR1和NtTOR2基因的表達(dá)量與突變體2細(xì)胞體積的增加有關(guān)。Hendelman等[22]通過葉形態(tài)解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SlARF10后，細(xì)胞體積變小，葉片中細(xì)胞總數(shù)減少，進(jìn)而抑制葉面積的增加。本研究中，突變體2的細(xì)胞總數(shù)顯著低于野生型，NtARF10-1和NtARF10-2基因的表達(dá)量顯著高于野生型，說明突變體2細(xì)胞總數(shù)的減少與NtARF10-1和NtARF10-2表達(dá)量的上調(diào)密切相關(guān)。Horváth等[23]研究指出，StEBP1表達(dá)量降低導(dǎo)致細(xì)胞體積增加，而過表達(dá)StEBP1則導(dǎo)致幼葉發(fā)育過程中細(xì)胞體積減小。本研究中，突變體1和突變體2幼葉中的NtEBP1的表達(dá)量顯著高于野生型，突變體1中的細(xì)胞體積顯著低于野生型，這與以往的研究結(jié)果相似，而突變體2中的細(xì)胞體積顯著高于野生型，結(jié)合突變體2中NtTOR1、NtTOR2和NtARF10-2的表達(dá)情況，初步推測(cè)NtTOR1和NtTOR2的高表達(dá)能夠恢復(fù)NtARF10-1、NtARF10-2和NtEBP1高表達(dá)所造成的細(xì)胞體積減小。因此，NtGRF8和NtGRF16表達(dá)量的下調(diào)與NtEBP1表達(dá)量的上調(diào)，可能是突變體1細(xì)胞體積小于野生型的原因，NtTOR1和NtTOR2表達(dá)量的上調(diào)可能是突變體2細(xì)胞體積大于野生型的原因，突變體1與突變體2中NtTOR1和NtTOR2的差異表達(dá)，可能是突變體1與突變體2細(xì)胞體積不同的原因。