蓋中朝， 王 兵

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 西安 710021； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025)

mTOR (mammalian Target of Rapamycin) 信號(hào)通路是真核生物細(xì)胞中控制分解代謝和合成代謝過程的關(guān)鍵通路之一，在細(xì)胞生長、增殖和死亡過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-3].在mTOR信號(hào)通路中，存在兩種由mTOR蛋白組成的核心復(fù)合物：mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) 和mTORC2 (mammalian target of rapamycin complex 2)，前者由mTOR， Raptor， mLST8， Deptor和PRAS40亞基組成，對雷帕霉素較為敏感；后者由mTOR， Rictor， mLST8， mSin1， Deptor和Proctor1/2亞基組成，對雷帕霉素不敏感[4-5].mTORC1主要控制生物大分子的合成代謝和分解代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長、細(xì)胞自噬等工程；mTORC2主要負(fù)責(zé)細(xì)胞骨架調(diào)配、細(xì)胞存活和部分細(xì)胞代謝過程.mTORC1和mTORC2在空間結(jié)構(gòu)上較為近似，整個(gè)復(fù)合物以二聚體形式組成一個(gè)近似菱形的擬二重軸結(jié)構(gòu)[6-7].

在mTOR信號(hào)通路中，TSC(Tuberous Sclerosis Complex)蛋白復(fù)合物位于mTORC1上游，且對后者具有負(fù)調(diào)控作用，TSC復(fù)合物由TSC1(Tuberous Sclerosis Complex 1)、TSC2(Tuberous Sclerosis Complex 2)和TBC1D7(TBC1 domain family member 7)三個(gè)亞基組成[4， 8].目前已知，TSC復(fù)合物與結(jié)節(jié)性硬化綜合癥有直接聯(lián)系，該病多見于皮膚、腦、腎、心臟和肺組織，臨床病理特征表現(xiàn)為面部皮脂腺瘤、癲癇發(fā)作和智能減退等[9-11].當(dāng)前認(rèn)為，結(jié)節(jié)性硬化癥的發(fā)病原因主要是由于TSC1和TSC2兩個(gè)腫瘤抑制基因發(fā)生突變所引起，二者所編碼的TSC1、TSC2蛋白和TBC1D7蛋白形成一個(gè)穩(wěn)定的TSC三亞基復(fù)合物.人類TBC1D7基因位于6號(hào)染色體上，全長TBC1D7蛋白包含293個(gè)氨基酸.有研究顯示，TBC1D7基因的突變會(huì)導(dǎo)致智障和巨腦癥的發(fā)生，一些偏頭痛患者基因組樣品中也存在TBC1D7基因的突變[12-13].

鑒于TBC1D7蛋白在mTOR通路和人類多種疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，所以對其生物學(xué)功能的研究就顯得尤為重要.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TBC1D7可以穩(wěn)定結(jié)合TSC1蛋白C末端區(qū)域，促進(jìn)后者發(fā)生二聚化并維持此二聚結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[14].目前已知，TSC1與TSC2蛋白相互作用，通過TSC2蛋白C末端的Rap-GAP結(jié)構(gòu)域來調(diào)控溶酶體膜表面Rheb蛋白的GTP/GDP結(jié)合狀態(tài)，最終負(fù)調(diào)控mTORC1的活性[15-16].但是，TBC1D7在mTOR通路中所扮演的角色及其對下游mTORC1的調(diào)控形式，均需要進(jìn)一步探索.本文以人類全長TBC1D7蛋白為研究對象，借助一系列分子生物學(xué)研究手段，通過一系列嘗試和探索，獲得了純化的TBC1D7蛋白，并通過在人類心肌細(xì)胞系(HCM)中高表達(dá)和敲降TBC1D7基因的表達(dá)，分析了TBC1D7對mTORC1復(fù)合物活化的影響.研究結(jié)果顯示，當(dāng)人類心肌細(xì)胞細(xì)胞HCM高表達(dá)Flag-TBC1D7時(shí)，細(xì)胞內(nèi)S6K1蛋白Thr389磷酸化程度降低，表明mTORC1活化程度降低，而當(dāng)HCM細(xì)胞內(nèi)TBC1D7表達(dá)被敲降時(shí)，檢測發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)S6K1蛋白Thr389磷酸化升高，表明mTORC1活化程度提高.這一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TBC1D7對mTORC1的活性調(diào)控發(fā)揮了重要作用.

1 材料與方法

1.1 試劑與引物

PCR實(shí)驗(yàn)所使用的高保真DNA聚合酶(貨號(hào)：AP221-02)購自天根生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI(1161A)、XhoI(1094A)、HindIII(1094A)、BamHI(1094A)、EcoRI(1040A)以及T4 DNA連接酶(2011A)購自日本寶生物公司；質(zhì)粒抽提試劑盒(GK2002-200)、PCR產(chǎn)物純化以及膠回收試劑盒(GK2043-200)購自上海捷瑞生物工程有限公司；LB培養(yǎng)基(A507002)購自上海生工生物工程有限公司；Trizol試劑(10296010)購自Thermo公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR116-02)和定量PCR試劑(FP215-02)均購自天根生物工程有限公司；凝血酶(605157)購自美國Sigma公司；GAPDH(ab181602)、S6K1(ab9366)、TBC1D7(ab234684)、pS6K1(Thr389)(ab60948)一抗以及Protein A Beads(ab193255)購自澳大利亞Abcam公司；引物及shRNA均由擎科生物工程有限公司合成，序列信息如表1所示.

表1 本研究中所使用的引物及shRNA序列

注：小寫字母部分為酶切位點(diǎn)序列

Notes: The lowercase parts are the sequence of digestion sites

1.2 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒

克隆構(gòu)建和原核表達(dá)所使用菌株為大腸桿菌EscherichiacoliTOP10菌株、EscherichiacoliBL21 (DE3)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所使用細(xì)胞為人心肌細(xì)胞系HCM；pET28a、pcDNA-Flag、pGreenPuro表達(dá)載體均為本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.3 序列保守性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

從Uniprot數(shù)據(jù)庫中分別下載人類(Homosapiens， Q9P0N9)、原雞(Gallusgallus， A0A1L1RR07)、斑馬魚(Daniorerio， F1QRX7)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis， F6UMY3)、家蠶(Bombyxmori， H9JMN1)、果蠅(Drosophilamelanogaster， Q9VCC4)以及粗壯厭氧真菌(Anaeromycesrobustus， A0A1Y1XIW3)的TBC1D7蛋白氨基酸序列，使用Clustal W 程序?qū)ζ溥M(jìn)行序列比對.

1.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以人類TBC1D7基因cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，并切膠回收目的條帶，將切回的包含目的條帶的凝膠使用膠回收試劑盒進(jìn)行溶膠和NDA回收，完畢后使用Nano-Drop設(shè)備檢測回收產(chǎn)物濃度.將化學(xué)合成的TBC1D7 shRNA在PCR儀中退火，收集產(chǎn)物以待連入載體中.

使用限制性內(nèi)切酶對回收的擴(kuò)增產(chǎn)物以及pET28a、pcDNA-Flag、pGreenPuro空載體在37 ℃水浴條件下酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后再次進(jìn)行純化回收，隨后使用Nano-Drop設(shè)備檢測產(chǎn)物濃度后，按照目的片段和載體3∶1的摩爾比將二者混合，使用T4 DNA連接酶連接二者，連接反應(yīng)在16 ℃條件下進(jìn)行4 h.

連接完畢后，取10 μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞.經(jīng)熱激和冰浴后，將感受態(tài)細(xì)胞加入1 mL LB培養(yǎng)基中活化，隨后離心附近菌體并將感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布至卡那霉素抗性的LB平板中，37 ℃培養(yǎng)過夜.通過菌落PCR檢測平板上的單克隆，并挑取陽性克隆進(jìn)行搖管培養(yǎng)，14 h后提取質(zhì)粒并將質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證.測序正確的質(zhì)粒樣品可用于下一步研究.

1.5 蛋白的原核表達(dá)

將構(gòu)建完成的pET28a-TBC1D7質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn) 化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞.第二天挑取單菌落接種至50 mL LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度達(dá)到A600=0.8～1.0時(shí)，再將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至2 L LB培養(yǎng)基中. 當(dāng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液濃度達(dá)到A600=0.8時(shí)，將培養(yǎng)溫度降至16度并加入終濃度為0.2 mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo).在16 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h，隨后離心收集所培養(yǎng)的菌體，并使用Ni柱平衡液(25 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0， 300 mmol·L-1NaCl， 20 mmol·L-1咪唑)進(jìn)行重懸.

1.6 Ni2+-NTA親和層析

使用高壓細(xì)胞均質(zhì)儀，在4 ℃條件下，以100 Mpa的壓力下進(jìn)行破壁.反復(fù)破壁3次后，將菌液在4 ℃，20 000 g條件下離心40 min，以去除不溶物.在離心的同時(shí)，使用預(yù)冷的Ni柱平衡液平衡Ni2+-NTA重力柱，離心完畢后立即將上清取出，加入Ni柱中，反復(fù)結(jié)合2遍后使用Ni柱平衡液沖洗5倍柱體積，隨后分別以60 mmol·L-1、200 mmol·L-1、500 mmol·L-1咪唑洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，各濃度洗脫10 mL.根據(jù) Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量，并使用12%濃度SDS-PAGE跑膠檢測蛋白純化情況.

1.7 凝血酶酶切去除組氨酸標(biāo)簽

取純化的His-TBC1D7蛋白，使用5 kDa孔徑的透析袋在4 ℃條件下對其進(jìn)行透析，透析緩沖液為PBS.透析12 h后，取出His-TBC1D7蛋白，根據(jù) Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量并按照凝血酶單位數(shù)與蛋白毫克數(shù)為2∶1的比例加入凝血酶，繼續(xù)在4 ℃條件下酶切12 h.酶切完畢后，將酶切產(chǎn)物跑12% SDS-PAGE檢測酶切是否完全，若殘存有部分His-TBC1D7，可以將酶切產(chǎn)物再次掛Ni2+-NTA層析柱，反復(fù)掛兩邊并收集流出液，通過此步驟去除存留的His-TBC1D7蛋白.使用Bradford法再次測蛋白產(chǎn)物濃度.

1.8 凝膠排阻層析

將去除標(biāo)簽后的TBC1D7蛋白使用10 kDa截留孔徑的超濾濃縮管，在4 ℃，4 000 g條件下進(jìn)行離心濃縮，直至總體積小于2 mL.隨后使用AKTA 蛋白液相層析系統(tǒng)(GE)結(jié)合Superdex200凝膠排阻層析柱(GE)，進(jìn)行層析分離.收集洗脫峰，跑SDS-PAGE膠檢測并將蛋白濃縮保存，最終獲得在溶液中狀態(tài)均一的TBC1D7蛋白.

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HCM細(xì)胞使用添加了10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次.細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用Lipo3000試劑，每6 cm培養(yǎng)皿使用15 μL轉(zhuǎn)染試劑以及10 μg質(zhì)粒(總量)，轉(zhuǎn)染完畢5 h后換入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24或48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

1.10 定量PCR

將細(xì)胞使用Trizol試劑提取總RNA，完畢后使用Nano-Drop設(shè)備測產(chǎn)物濃度.將總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照實(shí)際說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物再次測量濃度后分裝備用.使用反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，使用2×SYBR qPCR mix試劑，設(shè)置20 μL擴(kuò)增體系.使用BioRad CFX96 定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)讀取.擴(kuò)增數(shù)據(jù)處理使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.11 免疫沉淀及免疫印跡

使用含0.1% BSA的細(xì)胞裂解液稀釋Flag抗體，將50 μL Protein A Beads加入1 mL抗體稀釋液，在4 ℃條件下孵育結(jié)合2 h.孵育完畢后將Beads清洗5遍.隨后加入裂解后的組織總蛋白，在4 ℃條件下旋轉(zhuǎn)孵育過夜，離心后收集Beads.使用細(xì)胞裂解液清洗5遍后，將Beads使用1×Loading buffer 煮沸，離心收集上清備用.

將免疫沉淀獲取樣品使用10% SDS-PAGE電泳分離，完畢后將PAGE膠在200 mA橫流條件下濕轉(zhuǎn)75 min，于低溫條件下進(jìn)行.轉(zhuǎn)膜完畢后使用含5%脫脂奶粉的TBS-Tween溶液進(jìn)行封閉，隨后一抗4 ℃孵育過夜，洗膜3次后再次以HRP二抗室溫孵育60 min，完畢后洗膜3次并使用ECL藥水進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測.

1.12 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析

從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)中下載TBC1D7結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(PDB id: 4Z6Y)，使用PyMOL軟件(版本：1.7)對TBC1D7分子進(jìn)行靜電勢和保守性分析及顯示[17-18].

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸序列保守性分析

人類TBC1D7蛋白包含293個(gè)氨基酸，從功能方面而言，該蛋白具有TBC1結(jié)構(gòu)域(第50～231位氨基酸區(qū)域)，具有Rab-GAP活性，可以直接激活Rab蛋白的GTPase活性[19].該功能在進(jìn)化上較為保守，多物種來源的TBC1D7序列相似性較高，其在物種進(jìn)化過程中保持高度的保守性，尤其是其N端結(jié)構(gòu)域(圖 1).一般而言，在進(jìn)化上保持高度保守的蛋白在生命活動(dòng)中大多扮演著重要角色，這也在一定程度上可以解釋為何TBC1D7基因突變與人類多種疾病有關(guān).

圖1 多物種來源TBC1D7蛋白氨基酸序列比對Fig.1 Sequence alignment of TBC1D7 from different species

2.2 人類TBC1D7蛋白分子表面殘基保守性及電勢能分析

在得到TBC1D7蛋白氨基酸序列保守性結(jié)果后，進(jìn)一步分析了人類TBC1D7蛋白三維結(jié)構(gòu)信息，計(jì)算了蛋白分子表面電勢能以及表面殘基保守性.

結(jié)果顯示，人類TBC1D7蛋白空間結(jié)構(gòu)近似“半月形”，表面均勻分布了正負(fù)電荷，疏水區(qū)較少.進(jìn)一步的表面保守性顯示，人類TBC1D7蛋白表面保守殘基較為集中，主要位于“半月形”結(jié)構(gòu)的背部，該結(jié)果說明有潛在的相互作用蛋白與TBC1D7在該區(qū)域結(jié)合(圖2).

2.3 TBC1D7的克隆與表達(dá)

目前用于蛋白表達(dá)的系統(tǒng)有使用較多的有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，相比較而言，三者中大腸桿菌表達(dá)系

A) 人類TBC1D7蛋白三維結(jié)構(gòu)表面靜電勢，藍(lán)色為正電區(qū)，紅色為負(fù)電區(qū)，灰色為疏水中性區(qū)域；B) 人類TBC1D7蛋白三維結(jié)構(gòu)表面殘基保守性分析，青色區(qū)域?yàn)榉潜Ｊ匕被釁^(qū)域，灰色為中度保守區(qū)，紫紅色區(qū)域?yàn)楦叨缺Ｊ貐^(qū)A) Electrostatic potential of TBC1D7： blue regions represents positive， and red regions represents negative; B) Surface conversation of human TBC1D7: cyan region represents variable residues and purple means conversed residues圖2 人類TBC1D7蛋白分子表面殘基保守性及電勢能分析Fig.2 Electrostatic potential and surface conversation of human TBC1D7

統(tǒng)最為經(jīng)濟(jì)、快捷，可以用于多種原核和真核生物來源基因的高效表達(dá).pET28a質(zhì)粒是一種較為常用和高效的原核表達(dá)載體，在N 端和C 端各有一個(gè)6×His標(biāo)簽，在His標(biāo)簽之后存在thrombin酶切位點(diǎn)，載體啟動(dòng)子為T7啟動(dòng)子， 目的基因被克隆到質(zhì)粒載體上，受噬菌體強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制，并且目的蛋白的表達(dá)將被T7終止子所終止蛋白翻譯，蛋白質(zhì)的表達(dá)可由IPTG誘導(dǎo).

全長TBC1D7基因包括882 bp，通過酶切位點(diǎn)分析后選擇了NdeI和XhoI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，通過引物合成和后續(xù)的PCR過程，將其連在了目的片段的兩端.將目的片段和pET28a載體分別通過酶切和回收，隨后完成連接、轉(zhuǎn)化和表達(dá)鑒定過程(圖3A、3B).

由于采用了低溫誘導(dǎo)的策略來表達(dá)目的蛋白，所以得到的蛋白大多為可溶蛋白，通過高壓破碎細(xì)胞壁后，蛋白從菌體內(nèi)部釋放出來.由于TBC1D7蛋白融合表達(dá)His標(biāo)簽，根據(jù)組氨酸與Ni2+離子特異性吸附的特點(diǎn)，使用Ni2+-NTA柱來純化目的蛋白.將破壁離心后的菌液反復(fù)掛柱數(shù)次，隨即使用平衡液沖洗除雜.最終，通過60 mmol·L-1、200 mmol·L-1和500 mmol·L-1咪唑溶液梯度洗脫，收集洗脫樣品.由于His-TBC1D7蛋白的理論分子量約為36 kDa，所以為了方便清楚地鑒定蛋白純化結(jié)果，使用12% SDS-PAGE凝膠來分離目的蛋白，發(fā)現(xiàn)在200 mmol·L-1咪唑濃度條件下，大部分蛋白可以被洗脫下來，并且純度較高(圖3C).

2.4 TBC1D7蛋白的純化

在親和層析完畢后，得到了在N端融合有His標(biāo)簽的TBC1D7蛋白.考慮到His標(biāo)簽可能會(huì)對后續(xù)蛋白功能研究存在影響，需要去除TBC1D7蛋白N端融合的His標(biāo)簽.由于pET28a載體在His標(biāo)簽與目的蛋白之間存在一個(gè)凝血酶酶切位點(diǎn)(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser)編碼序列，所以該載體表達(dá)的蛋白也存在著該酶切位點(diǎn).

由于通過Ni2+親和層析所得到蛋白融合中存在這較高濃度的咪唑，而高濃度的咪唑比例與酶切的進(jìn)行，所以通過透析的手段去除了蛋白溶液中所含的高濃度咪唑.隨后通過使用凝血酶將His標(biāo)簽與TBC1D7蛋白切開，并通過進(jìn)一步的凝膠排阻層析手段來最終得到純化的TBC1D7蛋白.根據(jù)Superdex200凝膠排阻層析柱標(biāo)準(zhǔn)品洗脫相對分子量公式計(jì)算，發(fā)現(xiàn)TBC1D7蛋白的表觀相對分子量為38 k， 非常接近理論分子量36 k，由此推斷，TBC1D7蛋白在溶液中以單體形式存在.層析完畢后，收集最終的洗脫蛋白并通過Bradford方法測蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)通過該策略最終每升大腸桿菌菌液可以獲得12 mg純化的TBC1D7蛋白(圖4A、B).

圖3 TBC1D7的克隆與表達(dá)A) 雙酶切方法驗(yàn)證所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒，左側(cè)泳道為空載體酶切產(chǎn)物，箭頭所指為目的片段;B)轉(zhuǎn)化后大腸桿菌表達(dá)檢測；C)Ni2+親和層析純化His-TBC1D7融合蛋白;WCL：全細(xì)胞裂解液；P：沉淀；SUP：上清；FT：流穿液；60、200、500分別為 60，200，500 mmol/L 咪唑緩沖液洗脫的蛋白組分Fig.3 Clone and expression of TBC1D7A)Double digestion of constructions;B)Expression of transformed E.coli;C)Purification of His tagged TBC1D7 protein through Ni2+ affinity chromatography; WCL：Whole cell lysate；P: Pellet；SUP：Supernatant；FT：Flow through；60、200、500: 60，200，500 mmol·L-1 imidazole buffer elution

A) TBC1D7蛋白經(jīng)Superdex200凝膠排阻層析柱洗脫峰形圖；B) 12% SDS-PAGE 檢測A圖中的各洗脫組分A) Elution curve of SEC； B) Elution fractions dissolved in 12% SDS-PAGE圖4 凝膠排阻層析純化TBC1D7蛋白Fig.4 Purification of TBC1D7 through Size exclusion chromatography

2.5 TBC1D7的過表達(dá)和敲降

首先我們構(gòu)建了過表達(dá)質(zhì)粒：pcDNA-Flag-TBC1D7和敲降質(zhì)粒：pGreenPuro-shTBC1D7，并將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCM細(xì)胞，分別于0 h(對照)、24 h和48 h收集細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄.定量PCR實(shí)驗(yàn)對檢測基因高表達(dá)和敲降水平，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行t-test分析，結(jié)果證實(shí)所構(gòu)建的TBC1D7過表達(dá)(圖5A)和敲降(圖5B)質(zhì)粒均可有效地發(fā)揮作用，在轉(zhuǎn)染后24 h即可顯著上調(diào)或下調(diào)TBC1D7的表達(dá).

A) TBC1D7的過表達(dá)檢測；B) TBC1D7的敲降檢測.圖中**表示p<0.01A) Overexpression of TBC1D7. B) Knock-down of TBC1D7. ** indicates p<0.01.圖5 定量PCR檢測TBC1D7的過表達(dá)和敲降Fig.5 Up-and down-regulation of TBC1D7 measured by qPCR

A) WB檢測TBC1D7表達(dá)水平的改變對mTORC1下游S6K1磷酸化的影響；圖B)與C)，WB條帶的相對灰度比例A) The phosphorylation level of S6K1(Thr389) that affected by up-and down-regulation of TBC1D7； B) and C) Quantitative of the gray scale of western blot bands in A圖6 TBC1D7表達(dá)水平的改變對mTORC1活性的影響Fig.6 The activity change of mTORC1 that affected by TBC1D7

2.6 TBC1D7表達(dá)水平的改變對mTORC1活性的影響

目前已知TBC1D7是TSC復(fù)合物的重要組成部分，然而TBC1D7在人類心肌細(xì)胞中對mTOR信號(hào)通路的影響尚有待確定[8].本研究中，以人心肌細(xì)胞系HCM為研究對象，通過高表達(dá)和敲降TBC1D7來改變胞內(nèi)TBC1D7的表達(dá)水平，檢測mTOR信號(hào)通路中mTORC1復(fù)合物活化水平標(biāo)志物：S6K1蛋白Thr389殘基的磷酸化情況，以確定TBC1D7的表達(dá)對mTORC1活化水平的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)在HCM細(xì)胞中高表達(dá)TBC1D7時(shí)，胞內(nèi)S6K1蛋白Thr389磷酸化程度降低，表明mTORC1活性受到抑制，而當(dāng)HCM細(xì)胞內(nèi)TBC1D7被敲降時(shí)，胞內(nèi)S6K1蛋白Thr389磷酸化升高，表明mTORC1活化程度提高(圖6).這一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在人心肌細(xì)胞中TBC1D7對mTORC1的活性調(diào)控發(fā)揮了重要的負(fù)調(diào)控作用.

2.7 TBC1D7與mTOR信號(hào)通路蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步深入了解TBC1D7在mTOR信號(hào)通路中的作用和功能，從String數(shù)據(jù)庫下載并分析了人類TBC1D7蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)[20].圖中綠色節(jié)點(diǎn)(Nodes)，如TSC1，TSC2，AKT1等代表TBC1D7的第一層(Fist shell)相互作用蛋白，在功能上具有非常緊密的聯(lián)系(圖7).除此之外，TBC1D7的相互作用網(wǎng)絡(luò)中包含諸如mTOR，Rheb， EIF4EBP1， MAPK， GSK3B等mTOR信

圖7 TBC1D7與mTOR信號(hào)通路蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Protein-protein network of TBC1D7 and mTOR signaling pathway

號(hào)通路關(guān)鍵蛋白.由此可見，TBC1D7蛋白在mTOR信號(hào)通路中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用.

3 討論

作為真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的關(guān)鍵途徑，當(dāng)mTOR通路中某個(gè)或某些蛋白發(fā)能功能受損時(shí)，真核生物機(jī)體則產(chǎn)生對應(yīng)的病理性變化.對于人類而言，目前已在包括直腸癌、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等惡性腫瘤疾病中發(fā)現(xiàn)mTOR蛋白的功能性突變[21-23]；TSC1/TSC2的突變致使其對下游mTORC1復(fù)合物抑制作用減弱，導(dǎo)致結(jié)節(jié)性硬化癥的發(fā)病[9]；此外，mTOR信號(hào)通路異常也被認(rèn)為與阿爾茨海默癥和昆廷頓舞蹈病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病相關(guān)[24-26].正因?yàn)槠湓谡婧松矬w內(nèi)發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用，mTOR信號(hào)通路從20世紀(jì)90年代初被發(fā)現(xiàn)至今仍在世界范圍內(nèi)被諸多實(shí)驗(yàn)室深入研究，但截止當(dāng)前，依然有許多未知之處等待深入研究.

除了已知的TSC1/2蛋白，真核細(xì)胞內(nèi)還存在著其它效應(yīng)蛋白可以介導(dǎo)TBC1D7蛋白的功能發(fā)揮.有研究人員發(fā)現(xiàn)果蠅體內(nèi)TBC1D7蛋白可以通過胰島素信號(hào)來調(diào)控機(jī)體生長，而這一過程不依賴TSC1/2[27].本研究中，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示AKT1和AKT3均與TBC1D7存在相互作用，有相關(guān)研究證實(shí)AKT可以磷酸化TBC1D7蛋白第124位絲氨酸(Ser)，通過磷酸化來調(diào)控后者與14-3-3ζ及β-TrCP2的相互作用，而14-3-3ζ又可通過與mTORC1復(fù)合物中Raptor亞基相互作用來抑制復(fù)合物的激酶活性[28-29].

作為mTOR信號(hào)通路的重要一員，TBC1D7蛋白與TSC1、TSC2形成三元復(fù)合物，以復(fù)合物形式發(fā)揮功能，此TSC復(fù)合物的功能異常可導(dǎo)致結(jié)節(jié)性硬化的發(fā)病.結(jié)節(jié)性硬化通常會(huì)導(dǎo)致心臟組織發(fā)生病變，心臟橫紋肌瘤(cardiac rhabdomyoma)是結(jié)節(jié)性硬化癥常見的臨床表現(xiàn)之一，此癥狀常在胎兒時(shí)期出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了胎兒的正常發(fā)育[30-31].對TSC復(fù)合物的作用機(jī)理進(jìn)行研究可進(jìn)一步了解結(jié)節(jié)性硬化的發(fā)病，并促進(jìn)新型診療手段的出現(xiàn).雖然目前尚未在結(jié)節(jié)性硬化癥患者中發(fā)現(xiàn)有TBC1D7基因突變的情況，但是目前已知TBC1D7基因的突變卻可以導(dǎo)致其他一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如巨頭癥、智障、視神經(jīng)萎縮等[12，32].此外，有研究者發(fā)現(xiàn)，相較于野生型小鼠，糖尿病模型小鼠心臟組織中TBC1D7蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示TBC1D7作為一個(gè)潛在的調(diào)節(jié)因子參與至糖尿病性心肌病的調(diào)控之中[33].因此，對TBC1D7蛋白的生物學(xué)功能研究就顯得尤為重要.本研究建立了一種簡單有效的人類TBC1D7蛋白的表達(dá)純化策略，并研究了在人類心肌細(xì)胞中TBC1D7的表達(dá)與其下游mTOR信號(hào)通路之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)TBC1D7蛋白可負(fù)調(diào)控下游mTORC1復(fù)合物激酶活性，并與mTOR信號(hào)通路蛋白網(wǎng)絡(luò)存在緊密聯(lián)系.本研究為人類TBC1D7蛋白和mTOR信號(hào)通路的進(jìn)一步研究打下了良好基礎(chǔ).