付輯光,高艷霞,李 妍,李秋鳳,曹玉鳳,張秀江,李建國(guó)? (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定0700;.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定0700;.保定市農(nóng)業(yè)局,河北 保定07000)

銅參與生物體所必需的許多生化過(guò)程,是生物體必需的微量元素[1]。缺銅會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、泌乳、結(jié)締組織發(fā)育與色素沉著造成影響[2],而飼喂高銅飼糧也會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷[3]。因此,深入研究飼糧銅對(duì)奶牛代謝的影響及機(jī)理,對(duì)泌乳牛飼糧中合理利用銅元素有重要意義。李毓雯等[4]給大鼠飼喂銅水平為1 g/kg的飼料,隨著飼喂時(shí)間的增長(zhǎng),肝臟中組織凋亡基因Bax的表達(dá)量顯著性升高,對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷。LEE 等[5]報(bào)道,在閹牛飼糧中添加10～20 mg/kg銅能夠促進(jìn)皮下脂肪的脂類(lèi)代謝,但對(duì)特定脂肪基因的表達(dá)無(wú)影響。SINCLAIR 等[6]提出,在以硫酸銅為銅源的飼糧中添加硫與鉬會(huì)顯著提高抗氧化蛋白1(ATOX1)m RNA 的表達(dá)量。HAN 等[7]對(duì)犢牛的研究表明,高于正常值的肝臟銅濃度與肝臟銅離子轉(zhuǎn)出蛋白B(ATP7B)、銅-鋅超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白(CCS)與超氧化物歧化酶1(SOD1)mRNA 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。高晨[8]研究表明,在雞飼糧中添加160 mg/kg納米氧化銅,空腸與回腸ATP7B m RNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高。宋明明等[9]在雛雞飼糧中添加不同銅源,在160 mg/kg銅添加水平下發(fā)現(xiàn)硫酸銅組ATP7B m RNA 相對(duì)表達(dá)量顯著高于微米氧化銅組與納米氧化銅組。但WARD 等[10]認(rèn)為,只有飼糧中銅拮抗劑濃度較高時(shí),使用有機(jī)銅的才會(huì)有作用。綜上所述,前人對(duì)銅與機(jī)體健康、脂肪代謝以及銅相關(guān)基因之間的關(guān)系進(jìn)行了研究,但對(duì)不同銅水平對(duì)奶牛銅相關(guān)基因影響的研究甚少,且結(jié)果不盡一致,有必要對(duì)此進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)通過(guò)在飼糧中添加不同水平的銅,研究其對(duì)奶牛泌乳、肝臟銅代謝蛋白及相關(guān)酶基因表達(dá)的影響,為探討銅對(duì)機(jī)體代謝的影響機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)在保定昊宇牧業(yè)公司奶牛場(chǎng)進(jìn)行。選擇60頭健康無(wú)疾病泌乳中期的荷斯坦奶牛,采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),隨機(jī)分為4組,每組15頭牛,各試驗(yàn)組組間平均胎次、產(chǎn)奶量與泌乳天數(shù)差異均不顯著。以飼料級(jí)五水硫酸銅為銅源,各試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上分別添加0,10,15與20 mg/kg銅(表1),試驗(yàn)Ⅰ組(銅水平8.09 mg/kg)、試驗(yàn)Ⅱ組(銅水平18.09 mg/kg)、試驗(yàn)Ⅲ組(銅水平23.09 mg/kg)與試驗(yàn)Ⅳ組(銅水平28.09 mg/kg)。試驗(yàn)期90 d。

1.2 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理試驗(yàn)牛采用散欄飼養(yǎng),自由采食與飲水,試驗(yàn)組將含有不同銅水平的預(yù)混料與精料混勻后再與粗飼料進(jìn)行攪拌,混勻后分別飼喂。試驗(yàn)用預(yù)混料定制于北京福維康生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)與樣品采集

1.3.1 產(chǎn)奶量及乳樣的采集 試驗(yàn)期間,每天記錄日產(chǎn)奶量,每月采集1次奶樣,早、中、晚各收集乳樣60 m L,將1 d中的乳樣按4∶3∶3比例混合均勻,用于乳成分的測(cè)定。

1.3.2 肝臟樣品的采集與處理 試驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)選擇3頭試驗(yàn)牛,繼續(xù)飼喂試驗(yàn)飼糧,采用肝臟活體采樣法采樣。在試驗(yàn)牛右側(cè)倒數(shù)第2與3根肋骨間隙與右前肢肘關(guān)節(jié)至髖結(jié)節(jié)連線(xiàn)的交點(diǎn)上方2.5～3.5 cm 處,用采樣器(長(zhǎng)12.0～15.0 cm,內(nèi)徑3.0 mm)采取肝臟組織0.5～1.0 g,采集出的肝臟樣品用生理鹽水漂洗干凈后用錫箔紙包好后迅速置于液氮中,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移到－80℃條件下凍存[12]。

1.4 樣品的測(cè)定

1.4.1 乳成分的測(cè)定 用乳成分分析儀Milko-ScanTMMars(丹麥)檢測(cè)乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、非脂固形物(SNF)、乳總固形物與體細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中報(bào)道的牛銅代謝相關(guān)基因序列與引物設(shè)計(jì)方法來(lái)設(shè)計(jì)引物,將β-actin作為管家基因,所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,其序列與參數(shù)見(jiàn)表2。

1.4.2 樣品總RNA 的提取與檢測(cè) 取50～100 mg的樣品,按照TRIzol(Ambion,美國(guó))試劑說(shuō)明書(shū)提取肝臟組織中的總RNA,取少量RNA 與染色劑(Thermo,美國(guó))混合,用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后將其放入凝膠成像系統(tǒng)Gel Image Sistem(SIM,美國(guó))內(nèi)觀察結(jié)果。

1.4.3 cDNA 合成 根據(jù)QuantiTect反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN,德國(guó))說(shuō)明書(shū)對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作,將合成的cDNA放入－20℃冰箱中儲(chǔ)存待測(cè)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表2 基因引物序列

1.4.4 熒光定量PCR 根據(jù)試劑盒BIO RAD(美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,反應(yīng)體系為20μL(表3)。

表3 RT-PCR 反應(yīng)體系

反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min,95℃變性15 s,60℃退火延伸,72℃40 個(gè)循環(huán)。通過(guò)RT PCR 儀(Eppendorf,德國(guó))來(lái)獲得Ct值,以β-actin為內(nèi)參,用2－ΔΔCt法計(jì)算出m RNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA 過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA,LSD),差異顯著時(shí)用Duncan法進(jìn)行各組間多重比較。以P＜0.05為差異顯著,以P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同銅水平對(duì)奶牛泌乳性能的影響由圖1可知,試驗(yàn)牛的產(chǎn)奶量隨著飼糧銅水平的增加呈上升趨勢(shì),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組產(chǎn)奶量顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P＜0.05),但試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組之間的產(chǎn)奶量差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 不同飼糧銅水平對(duì)泌乳牛產(chǎn)奶量的影響 ?.表示差異顯著(P＜0.05);??.表示差異極顯著(P＜0.01)。下同

由圖2可知,隨著飼糧銅水平的增加,乳脂率與乳蛋白率呈先增高后降低的趨勢(shì),但各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。不同飼糧銅水平對(duì)各試驗(yàn)組乳糖率、SNF與乳總固形物的含量無(wú)影響(P＞0.05)。

圖2 不同飼糧銅水平對(duì)泌乳牛乳成分的影響

由圖3可知,乳體細(xì)胞數(shù)隨著飼糧銅水平的增加而降低,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組的體細(xì)胞數(shù)極顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組(P＜0.01),但試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組之間差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 不同飼糧銅水平對(duì)泌乳牛乳體細(xì)胞數(shù)的影響

2.2 肝臟中總RNA 的純度與完整性檢測(cè)奶牛肝臟中提取的總RNA 經(jīng)NanoDrop2000檢測(cè),D260/D280均在1.9～2.1 之間。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后RNA 分子條帶清晰、無(wú)DNA 污染、完整性好(圖4)。

圖4 泌乳牛肝臟總RNA 提取檢測(cè)結(jié)果 1～3.Ⅰ組;4～6.Ⅱ組;7～9.Ⅲ組;10～12.Ⅳ組

2.3 飼糧銅水平對(duì)肝臟銅代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.1 飼糧銅水平對(duì)銅轉(zhuǎn)運(yùn)基因相對(duì)表達(dá)量的影響 由表4可知,ATP7B與CP mRNA 相對(duì)表達(dá)量隨著飼糧銅水平的增加逐漸增高,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組ATP7B m RNA 相對(duì)表達(dá)量比試驗(yàn)Ⅰ組分別提高36%,63%與95%(P＜0.01),CP m RNA 相對(duì)表達(dá)量的變化規(guī)律與ATP7B mRNA 相對(duì)表達(dá)量的變化規(guī)律一致。COMMD1 m RNA 相對(duì)表達(dá)量隨著飼糧銅水平的增加呈先增高后降低的趨勢(shì),與試驗(yàn)Ⅰ組相比,試驗(yàn)Ⅱ組的COMMD1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量提高了9%(P＞0.05),試驗(yàn)Ⅲ與Ⅳ組分別降低54%與78%(P＜0.01)。ATOX1、CCS 與CUTC m RNA 相對(duì)表達(dá)量各組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表4 銅對(duì)銅轉(zhuǎn)運(yùn)因子ATOX1、ATP7B、CP、CCS、COMMD1與CUTC m RNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.2 飼糧銅水平對(duì)含銅酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響 由表5 可知,隨著飼糧銅水平的增加,SOD1 m RNA 的相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì),與試驗(yàn)Ⅰ組相比,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組分別提高20%,46%與59%(P＜0.01)。LOX m RNA 的相對(duì)表達(dá)量隨著飼糧銅水平的增加呈上升趨勢(shì),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組比試驗(yàn)Ⅰ組分別提高15%(P＜0.05),67%(P＜0.01)與72%(P＜0.01)。隨著飼糧銅水平的增加,MAOA m RNA 的相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組比試驗(yàn)Ⅰ組分別提高33%,38%與59%(P＜0.01)。MAOB mRNA 的相對(duì)表達(dá)量隨著飼糧銅水平的增加呈降低趨勢(shì),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ與Ⅳ組比試驗(yàn)Ⅰ組分別降低24%,34%與60%(P＜0.01)。

表5 銅對(duì)基因SOD1、LOX、MAOA 與MAOB m RNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

銅主要在胃與小腸上段被吸收,經(jīng)血液送至肝臟及全身,除一部分以銅蛋白形式儲(chǔ)存于肝臟外,其余或在肝臟內(nèi)合成銅藍(lán)蛋白,或在各組織內(nèi)合成過(guò)氧化物歧化酶、細(xì)胞色素C 氧化酶、酪氨酸酶與單胺氧化酶等。這些銅蛋白與銅酶在機(jī)體內(nèi)參與清除自由基、電子轉(zhuǎn)移、黑色素形成與神經(jīng)遞質(zhì)形成等酶促反應(yīng),對(duì)穩(wěn)定機(jī)體的平衡狀態(tài)發(fā)揮著重要的生理作用[13]。銅雖然是氧化還原反應(yīng)的輔助因子,但是體內(nèi)的游離銅離子會(huì)催化過(guò)氧化氫與超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為羥基自由基,這些羥基自由基會(huì)引起DNA、脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的非特異性氧化[14-15]。銅對(duì)機(jī)體的兩面性是因?yàn)殂~既可以釋放電子又可以接收電子,并負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)超氧化物與其他活性氧的產(chǎn)生,即使在較低濃度的情況下也具有很強(qiáng)的毒性,因此動(dòng)物機(jī)體對(duì)銅的吸收、分配與排出都要受到嚴(yán)格調(diào)控[16-17]。如果在細(xì)胞中進(jìn)行的氧化還原反應(yīng)不受控制,銅會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)與DNA 造成破壞與不可挽回的損傷[18-19]。

3.1 飼糧銅水平對(duì)泌乳性能的影響黃志秋等[20]研究表明,在泌乳牛飼糧中添加7.6 mg/kg銅,能使產(chǎn)奶量提高了4.85%～9.61%,但乳脂率卻沒(méi)有明顯變化。劉明祥等[21]對(duì)分娩100～120 d的荷斯坦奶牛補(bǔ)飼銅,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在飼養(yǎng)120 d后,補(bǔ)銅組奶牛的奶產(chǎn)量比對(duì)照組提高3.30%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著飼糧銅水平的提高,產(chǎn)奶量、乳脂率與乳蛋白率均有所提高,但飼糧銅水平為28.09 mg/kg 的試驗(yàn)Ⅳ組的產(chǎn)奶量與飼糧銅水平為23.09 mg/kg的試驗(yàn)Ⅲ組的產(chǎn)奶量相比反而有所下降,本試驗(yàn)結(jié)果與劉曦[22]的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)槟膛?duì)銅的需要量受其自身?xiàng)l件與外部條件的影響[23],在這些條件的約束下,會(huì)有一個(gè)適宜的銅需要量,而過(guò)高的飼糧銅水平會(huì)對(duì)奶牛機(jī)體造成負(fù)影響,從而對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能造成負(fù)面影響。

3.2 飼糧銅水平對(duì)泌乳牛銅轉(zhuǎn)運(yùn)基因相對(duì)表達(dá)量的影響參與銅轉(zhuǎn)運(yùn)的銅伴侶蛋白之間通過(guò)相互協(xié)調(diào)確保銅離子被運(yùn)送到特定區(qū)域而不被提前釋放,這一功能在銅代謝與維持細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[24]。銅伴侶蛋白既能結(jié)合銅離子并協(xié)助運(yùn)輸銅離子至靶蛋白,又能通過(guò)完成細(xì)胞內(nèi)銅的轉(zhuǎn)運(yùn)而維持胞質(zhì)中銅離子的生理濃度。若銅伴侶蛋白合成不足,必定會(huì)引起銅代謝異常,導(dǎo)致疾病。ATOX1,CCS,ATP7B,COMMD1,CP與CUTC 都是重要的銅轉(zhuǎn)運(yùn)基因,這些銅伴侶基因的表達(dá)介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)銅的穩(wěn)態(tài)。

ATOX1在細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。ATOX1捕獲胞質(zhì)中的銅,與銅結(jié)合后將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到ATP酶上,隨后在ATP酶的作用下將銅轉(zhuǎn)移到反式高爾基網(wǎng)絡(luò)的銅泵中,從而促使銅供應(yīng)到靶細(xì)胞,用于銅依賴(lài)性酶的生成[25]。細(xì)胞內(nèi)的銅濃度過(guò)高會(huì)誘導(dǎo)ATP 酶遷移,在ATP酶的作用下將多余的銅轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞以維持胞內(nèi)銅水平的穩(wěn)定[26]。ATOX1蛋白不僅具有運(yùn)輸銅的作用,還有抗氧化損傷的功能[27]。SINCLAIR 等[6]研究表明,在以硫酸銅為銅源的飼糧中添加銅拮抗劑能提高肝臟ATOX1 mRNA 的表達(dá)量,但差異不顯著;MULLER 等[28]在大鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),高銅對(duì)ATOX1 m RNA 表達(dá)量沒(méi)有影響。本試驗(yàn)研究表明,ATOX1 m RNA 的相對(duì)表達(dá)量隨著飼糧銅水平的增加有下降趨勢(shì),但各組差異不顯著。這可能是因?yàn)殡S著飼糧銅水平的增加,銅代謝的其他途徑被激活[29]。韓勝旗[30]通過(guò)對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著硫酸銅添加量的增加,ATOX1 m RNA表達(dá)量顯著降低,與本試驗(yàn)結(jié)果不一致。這可能是因?yàn)椴煌~水平下,體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因表達(dá)情況與體內(nèi)試驗(yàn)機(jī)體的基因表達(dá)情況存在差異,但需進(jìn)一步研究證實(shí)。

CCS是銅伴侶蛋白家族中的一員[31],是將銅特異性地傳遞到胞液中抗氧化酶SOD1 上的專(zhuān)一蛋白[32],促使SOD1形成二硫鍵并將其激活[26]。CCS蛋白的這一特異性功能是因?yàn)槠渚哂孝衽cⅡ2個(gè)結(jié)構(gòu)域,在向SOD1傳遞銅時(shí),結(jié)構(gòu)域I的作用在銅充足條件下是微不足道的,但是在銅缺乏條件下卻會(huì)發(fā)揮重要作用,這表明結(jié)構(gòu)域I在有限銅的競(jìng)爭(zhēng)中起著至關(guān)重要的作用。結(jié)構(gòu)域Ⅱ是SOD1異二聚化所必需的,能夠促進(jìn)銅插入SOD1[33]。在對(duì)牛的研究中發(fā)現(xiàn),銅缺乏可以引起牛的十二指腸、肝臟與紅細(xì)胞中CCS蛋白含量顯著提高[34]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼糧中銅水平與CCS m RNA 相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有相關(guān)性。BERTINATO 等[35]對(duì)大鼠的研究表明,缺銅越嚴(yán)重CCS蛋白含量越高,而CCS m RNA 含量沒(méi)有變化,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這可能是因?yàn)镃CS蛋白水平增加是由于26S蛋白酶抑制了蛋白降解,而非由于m RNA 的高表達(dá)引起的[36]。

ATP7B 編碼一種參與銅運(yùn)輸?shù)腜 型ATP酶[37],肝臟銅的輸出主要經(jīng)由2個(gè)途徑:(1)ATP7B將肝臟細(xì)胞內(nèi)的銅轉(zhuǎn)運(yùn)給血清CP,形成全CP 后,將銅分泌到血液中[38-39];(2)胞質(zhì)內(nèi)的銅由功能完整的ATP7B 基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)給溶酶體,通過(guò)胞吞作用將銅排到膽汁中[40],由此可見(jiàn),ATP7B在銅代謝通路上扮演重要角色[41]。MINGHETTI等[42]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加銅可顯著提高金頭鯛體內(nèi)ATP7B m RNA 的表達(dá)。李俐華[43]通過(guò)對(duì)Wistar雄性大鼠進(jìn)行硫酸銅(0.02與0.04 mg/kg)圓窗給藥后,發(fā)現(xiàn)大鼠耳蝸內(nèi)ATP7B m RNA 表達(dá)量與ATP7B蛋白呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。本試驗(yàn)證實(shí),隨著飼糧銅水平的提高,ATP7B m RNA 相對(duì)表達(dá)量顯著提高,說(shuō)明隨著飼糧銅水平的提高,機(jī)體為了自身保護(hù),通過(guò)增加膽汁的分泌與腸道排泄等途徑將多余的銅離子排出體外[43]。另?yè)?jù)報(bào)道,當(dāng)肝臟銅濃度較高時(shí)會(huì)下調(diào)ATP7B的基因表達(dá)量[44]。這種差異可能是因?yàn)楫?dāng)機(jī)體內(nèi)銅含量較高時(shí),二價(jià)銅離子會(huì)與細(xì)胞膜的巰基結(jié)合而使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化[45],還可能是因?yàn)殂~能夠使氧化還原劑構(gòu)象重排而使其活性受到抑制,導(dǎo)致抗氧化酶活性降低[46-47]。在本試驗(yàn)中,飼糧中銅水平為28.09 mg/kg時(shí),ATP7B m RNA 相對(duì)表達(dá)量最高,對(duì)于更高銅水平對(duì)ATP7B m RNA 表達(dá)量的影響尚需進(jìn)一步研究。

COMMD1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的COMMD 蛋白,代表了家族的原型,是家族里最具特色的一員[48],參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的生理過(guò)程[49-51]。ATP7B 基因在轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程中的突變會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的錯(cuò)誤折疊與功能失調(diào),COMMD1 促進(jìn)突變與錯(cuò)誤折疊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降解,這使得COMMD1參與新合成的ATP7B蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制,從而調(diào)節(jié)機(jī)體的銅穩(wěn)態(tài)[52]。若COMMD1合成不足會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞中銅超載與銅的膽汁排泄障礙,這會(huì)導(dǎo)致肝硬化,造成肝臟與腦的損傷[53]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在飼糧銅水平為18.09 mg/kg時(shí),COMMD1 m RNA 相對(duì)表達(dá)量較銅水平為8.09 mg/kg的Ⅰ組有所上升,說(shuō)明飼糧銅水平為18.09 mg/kg時(shí)能更好的調(diào)控機(jī)體銅穩(wěn)態(tài)。當(dāng)飼糧銅水平達(dá)到23.09 mg/kg時(shí)COMMD1 m RNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低,但ATP7B m RNA 相對(duì)表達(dá)量隨著飼糧銅水平的提高顯著升高,這可能是因?yàn)镃OMMD1基因既能誘導(dǎo)沒(méi)有達(dá)到完全折疊的ATP酶降解,又能穩(wěn)定與促進(jìn)新合成的ATP酶的折疊。正是這種雙重作用使得COMMD1下調(diào)后ATP酶水平不一致。

CP是一種含銅的糖蛋白,是由肝臟合成的具有氧化酶活性的蛋白質(zhì),屬于多銅氧化酶[54]。在血液循環(huán)中銅藍(lán)蛋白可視為銅的沒(méi)有毒性的代謝庫(kù)[55],是細(xì)胞獲取銅的最優(yōu)先來(lái)源,并且CP 中的銅轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的速度比其他途徑都要快[56],這是因?yàn)榧?xì)胞表面存在有CP受體,該受體可誘導(dǎo)CP發(fā)生構(gòu)象變化并釋放出銅原子[57]。喬晶晶等[58]研究表明,銅濃度越高黃河鯉CP mRNA 表達(dá)量最高峰出現(xiàn)的越早。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí),隨著飼糧中銅水平的提高CP m RNA 表達(dá)量極顯著提高,這與LIN 等[59]研究結(jié)果一致。而王春秀[60]研究表明,在CP m RNA 表達(dá)最高峰的出現(xiàn)后,隨著銅刺激時(shí)間的延長(zhǎng),黃河鯉CP mRNA 表達(dá)量會(huì)適度降低,這可能是因?yàn)楦咩~會(huì)對(duì)肝臟與胰臟造成中毒性損傷,影響了CP 的合成效率。

CUT 基因家族與銅動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控有關(guān),它主要在銅的攝取、儲(chǔ)存、運(yùn)輸與排出過(guò)程中發(fā)揮作用,CUTC是該家族中的一員[61]。LATORRE 等[62]在培養(yǎng)基中加入硫酸銅研究證實(shí),糞腸球菌長(zhǎng)時(shí)間處于高銅環(huán)境下會(huì)使CUTC m RNA 的表達(dá)水平顯著增加近3倍。在植物病原體中的轉(zhuǎn)錄分析顯示,銅濃度增加會(huì)誘導(dǎo)CUTC的表達(dá)[63],所有這些研究都表明CUTC參與調(diào)節(jié)銅穩(wěn)態(tài)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著飼糧中銅水平的提高,各試驗(yàn)組CUTC m RNA相對(duì)表達(dá)量之間沒(méi)有差異,但CALAFATO 等[64]在線(xiàn)蟲(chóng)中觀察到相反的結(jié)果,該基因的表達(dá)會(huì)在銅濃度升高時(shí)被抑制,這可能是與不同試驗(yàn)對(duì)象對(duì)銅的需要量與耐受程度不同有關(guān)。

3.3 飼糧銅水平對(duì)含銅酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響SOD1 是一種廣泛存在于生物中的酶。HANSEN 等[65]在對(duì)牛的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),銅元素缺乏會(huì)導(dǎo)致SOD1 mRNA 表達(dá)量下降。韓勝旗[30]通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)納米氧化銅質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/L 時(shí)豬小腸上皮細(xì)胞內(nèi)SOD1 m RNA 表達(dá)量最高,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L時(shí),SOD1 m RNA 表達(dá)量開(kāi)始顯著降低,而硫酸銅對(duì)SOD1 mRNA 表達(dá)量沒(méi)有影響。SUAZO 等[66]利用人的單核細(xì)胞證明高銅會(huì)使機(jī)體內(nèi)血清銅的含量增加,而SOD1 m RNA 表達(dá)量下降。本試驗(yàn)研究表明,飼糧中添加銅可以顯著提高SOD1 m RNA 的相對(duì)表達(dá)量,對(duì)于進(jìn)一步提高飼糧銅水平對(duì)奶牛SOD1 m RNA 表達(dá)量的影響尚需進(jìn)一步研究?？傊?提高飼糧銅水平可以提高奶牛SOD1 m RNA 相對(duì)表達(dá)量,從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,但并非飼糧銅水平越高抗氧化能力就越強(qiáng)。

LOX 功能廣泛,不僅能夠?qū)⒓?xì)胞外基質(zhì)膠原與彈性蛋白的賴(lài)氨酸殘基脫氨形成分子間的交聯(lián),穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì),保持細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,還能夠抑制原癌基因家族中的Ras癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變,從而抑制腫瘤的形成[67]。LOX 氧化彈性蛋白與膠原中的賴(lài)氨酸殘基,生成肽基α-氨基己二酸-δ-半醛,這個(gè)殘基會(huì)與相鄰的醛或氨基縮合形成共價(jià)席夫堿交聯(lián)[68],正是這種交聯(lián)結(jié)構(gòu)為結(jié)締組織提供了彈性,并且能夠抵抗非特異性蛋白酶對(duì)膠原或彈性蛋白的降解[69-70]。所有生物中膠原結(jié)締組織發(fā)育遲緩都與銅缺乏有關(guān)[71]。當(dāng)體內(nèi)銅缺乏時(shí),LOX 活性下降,會(huì)對(duì)膠原的發(fā)育造成阻礙[72],增加飼糧中的銅含量會(huì)增加雞肌腱中的賴(lài)氨酰氧化酶活性[73]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著飼糧中銅水平的提高,LOX mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著提高,飼糧中銅含量為23.09與28.09 mg/kg時(shí),LOX m RNA 相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。說(shuō)明飼糧中添加銅能顯著提高結(jié)締組織彈性,隨著飼糧銅水平的提高,LOX m RNA表達(dá)趨勢(shì)逐漸平緩。

MAO 是重要的含銅酶類(lèi),銅缺乏會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)代謝紊亂,可造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷[74]。根據(jù)MAO 對(duì)底物的親和力與對(duì)抑制物特異性的不同,MAO 分為單胺氧化酶A(MAOA)與單胺氧化酶B(MAOB)2個(gè)亞型,這2個(gè)亞型由不同的基因編碼[75]。MAOA 是一種含黃素的線(xiàn)粒體酶,它能夠催化多種胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的降解過(guò)程[76]。MAOA不足會(huì)增加血清素、去甲腎上腺素與多巴胺的濃度,MAOB不足會(huì)增加苯乙基胺的濃度[77]。血清素作為MAOA 代謝的一種底物,其含量的增加會(huì)使動(dòng)物的行為具有攻擊性[78]。MAOB 可以通過(guò)激活內(nèi)、外源的神經(jīng)毒素或是提高H2O2的水平來(lái)加速大腦的老化,隨著年齡的增大,MAOB的濃度升高,這會(huì)引起腦內(nèi)兒茶酚胺含量紊亂,生理活動(dòng)失調(diào),從而導(dǎo)致衰老的發(fā)生[79]。單胺氧化酶還是幾種神經(jīng)遞質(zhì)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶[80]。趙麗等[81]研究表明,飼喂高銅日糧能顯著提高雛鴨肝臟中單胺氧化酶活性。本試驗(yàn)證實(shí),隨著飼糧中銅水平的提高,MAOA m RNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高,而MAOB m RNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低,這與柴春彥等[74]研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)闄C(jī)體的銅狀況可直接影響單胺氧化酶這種神經(jīng)肽的生物合成過(guò)程[82],即通過(guò)影響MAO 的轉(zhuǎn)錄過(guò)程使MAOA m RNA 的表達(dá)量升高,MAOB mRNA 的表達(dá)量降低;也可能是因?yàn)轱暭Z中添加銅能夠使神經(jīng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性與受體功能正常,使得單胺類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)正常代謝,從而抑制動(dòng)物的攻擊性行為,減緩機(jī)體衰老[83],反饋性地影響MAO m RNA 的表達(dá),更深入的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

在本試驗(yàn)條件下,飼糧中添加銅能夠提高奶牛泌乳性能,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)銅的代謝與含銅蛋白的合成,增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。泌乳牛飼糧適宜銅水平為18.09～23.09 mg/kg,既能確保奶牛有較高的生產(chǎn)性能,又能有效上調(diào)泌乳牛肝臟銅代謝蛋白及相關(guān)酶基因的表達(dá)。