張 璐,黨秀麗,劉珍珍,胡蘇輝,王臣榮,菅復(fù)春? (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院/河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室,河南 鄭州45000;.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,河南 鄭州45000)

卵黃抗體(immunoglobulin of egg yolk,Ig Y)是通過免疫產(chǎn)蛋雞,由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應(yīng)的抗體,并可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療的制劑。Ig Y 具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)量高、利于生產(chǎn)、成本低廉,產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量小等優(yōu)點[1],并可作為捕獲或檢測抗體用來檢測哺乳動物免疫球蛋白,且具有更強的特異性和靈敏度。目前,Ig Y 的應(yīng)用范圍已經(jīng)擴展到保健品、醫(yī)藥衛(wèi)生及生物技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域,應(yīng)用前景良好[2-4]。

近年來,ELISA 方法以其較強的特異性,高靈敏度,操作簡便等優(yōu)點,在隱孢子蟲的檢測中得到應(yīng)用[5-7],但目前仍然沒有國產(chǎn)商品化的ELSIA 試劑盒可供使用,因此,建立檢測隱孢子蟲抗體的間接ELISA 方法很有必要[8-9]。本試驗嘗試制備抗隱孢子蟲的特異性Ig Y 抗體,可用于隱孢子蟲病的治療。在獲取特異性Ig Y 過程中,為檢測免疫雞群的抗體水平、Ig Y 抗體產(chǎn)生變化的動態(tài),建立了間接ELISA 檢測特異性Ig Y 抗體。

1 材料與方法

1.1 試驗動物從鄭州市某養(yǎng)雞場選擇并購買8只120日齡開產(chǎn)健康海蘭蛋雞,糞便檢查為隱孢子蟲陰性,血清學(xué)檢測顯示無抗隱孢子蟲抗體。

1.2 儀器及試劑超聲波細胞粉碎儀:Cole Parmer Instrument公司;紫外分光光度計:北京普析通用儀器有限公司;全自動酶標儀:Thermo 公司;HRP-兔抗雞Ig Y:上海艾博抗貿(mào)易有限公司;透析袋:北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 抗原的制備將提純后卵囊(108/m L)置液氮(－196℃)和水浴鍋37℃反復(fù)凍融5次,超聲波細胞粉碎儀(100 HZ)2 min×5 次破碎后,10 000 r/min離心15 min,其中,上清作為檢測用抗原,沉淀作為免疫用抗原。－20℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.4 抗原蛋白含量的測定采用紫外分光光度計法測定抗原蛋白含量。

1.5 免疫用疫苗的制備抗原與油佐劑等體積混合,放入50 m L EP管中于漩渦振蕩器上振蕩,乳化制成“油包水”乳狀液;用0～2.5μL 的移液槍吸取0.5μL滴入水面上,如果振蕩后的乳劑肉眼看不見擴散,則乳化合格,否則繼續(xù)振蕩直至乳劑滴在水面上肉眼看不見擴散為止。

1.6 蛋雞的免疫選擇8只120日齡開產(chǎn)健康海蘭蛋雞,4只用于隱孢子蟲抗原免疫制備Ig Y,4只不免疫作為陰性對照。參照邵兆霞等[11]的方法制定免疫程序和劑量,采取長期多次免疫法,首免劑量卵囊為1×107個/只,二免劑量卵囊為2×107個/只,三免劑量卵囊為2.5×107個/只,免疫方式為翅根部皮下及胸部肌肉多點注射法進行免疫。對照組以空白疫苗做相對應(yīng)的免疫。

1.7 卵黃的收集與純化收集免疫前雞蛋和對照組雞蛋作為陰性對照。首次免疫7 d后開始收集試驗組和對照組雞蛋并按照分組編號,將收集的雞蛋清潔消毒后,打破蛋殼,棄蛋清,用醫(yī)用一次性1 m L注射器吸取卵黃液置試管中,用9倍的滅菌單蒸水稀釋,之后采用二步硫酸銨法純化卵黃液[12]。

1.8 間接ELISA方法的建立

1.8.1 間接ELISA 程序 按常規(guī)方法在96孔聚丙乙烯微量板上進行。程序如下:抗原包被,洗滌,封閉,洗滌,加檢測樣品,洗滌,酶標抗體,洗滌,底物顯色,終止,測定吸光度值。

1.8.2 抗原和抗體最佳工作濃度的測定 采用方陣滴定法確定抗原最適包被濃度和一抗的最佳工作濃度。將純化抗原稀釋為1.0,2.0,2.5和3.0 mg/L共4個質(zhì)量濃度進行包被,每個質(zhì)量濃度重復(fù)4孔,每孔100μL,4℃過夜。用1%明膠進行封閉,陽性和陰性Ig Y 分別做200,400,800倍稀釋,每個稀釋度重復(fù)4孔,37℃孵育1 h。按照1.8.1間接ELISA程序進行操作,記錄結(jié)果。選取陽性Ig Y 平均D450nm接近1.00,相鄰平均D值出現(xiàn)較大變化并且P/N值達到最大的孔,確定抗原最適包被質(zhì)量濃度和抗體最佳稀釋度。

1.8.3 最佳包被條件的選擇 將抗原進行2.5 mg/L稀釋后包被酶標板,分別在以下3個條件下進行包被:37℃作用1 h后4℃過夜,37℃作用2 h后4℃過夜,4℃過夜,篩選最優(yōu)包被條件。

1.8.4 最佳酶標抗體工作濃度的選擇 96孔酶標板包被、封閉之后,樣品作1∶100倍稀釋,對酶標抗體進行2 000,3 000,5 000和8 000倍稀釋,100μL/孔,確定最佳工作濃度。

1.8.5 最佳一抗反應(yīng)時間的測定 加入一抗之后,將抗原抗體作用時間依次調(diào)整為30,45,60 min,確定最佳作用時間。

1.8.6 最佳酶標抗體反應(yīng)時間的測定 將酶標抗體做1∶3 000倍稀釋,并分別于37℃作用30,45,60 min,確定其最佳反應(yīng)時間。

1.8.7 最佳顯色時間的測定 對抗原作2.5 mg/L稀釋后包被酶標板,37℃作用2 h后4℃過夜,樣品作1∶400稀釋。加底物液后,分別避光顯色5,10,15,20 min,確定最佳顯色時間。

1.9 檢測性試驗

1.9.1 特異性試驗 采用已建立的間接ELISA 方法,對球蟲卵囊,圓線蟲蟲卵和賈第蟲抗原進行檢測,同時設(shè)立陽性和陰性對照,讀取D450nm值、記錄結(jié)果。

1.9.2 重復(fù)性試驗 以批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗來檢驗間接ELISA 方法的重復(fù)性,選取3份卵黃抗體樣本在不同時間、相同條件下重復(fù)做ELISA 測定,每個樣品重復(fù)4次,按照已建立的間接ELISA 操作程序測定,計算同一份樣本D450nm值的變異系數(shù)(CV),比較試驗結(jié)果。

1.9.3 敏感性試驗 將隱孢子蟲陽性Ig Y 從1∶400開始做2倍連續(xù)稀釋至1∶12 800,共做6個稀釋度,其他條件不變,按照已建立的間接ELISA 操作方法測定D450nm值,檢測其敏感性。以出現(xiàn)陽性的最高稀釋倍數(shù)推算其最小檢出量。

2 結(jié)果

2.1 抗原的蛋白含量經(jīng)紫外分光光度法測得本次制備的隱孢子蟲抗原蛋白含量為1.734 g/L。

2.2 抗隱孢子蟲卵黃抗體的收集與純化免疫前后,收集不同時間產(chǎn)出的雞蛋,按水稀釋二步硫酸銨法提取卵黃,純化Ig Y,獲得Ig Y 抗體。

2.3 間接ELISA方法的建立

2.3.1 抗原最適包被濃度及陰、陽性Ig Y 最佳稀釋度的確定 方陣滴定結(jié)果可知(表1),抗原包被質(zhì)量濃度為2.5 mg/L,一抗稀釋度為1∶400 時,D450nm接近于1.0,且此時P/N最大,故在ELISA檢測方法中抗原包被質(zhì)量濃度確定為2.5 mg/L,被檢樣品的稀釋倍數(shù)為1∶400。

2.3.2 最佳包被條件的選擇 由表2可知,37℃作用1 h后4℃過夜,37℃作用2 h后4℃過夜,4℃過夜等3種條件下包被,37℃作用2 h后4℃過夜條件下D450nm值最大,故采用此包被條件最佳。

2.3.3 最佳酶標抗體工作濃度的確定 最佳酶標抗體工作濃度的選擇結(jié)果如表3所示,因此確定最佳酶標抗體工作濃度為1∶3 000。

2.3.4 最佳一抗反應(yīng)時間的確定 最佳被檢卵黃抗體作用時間選擇結(jié)果如表4所示。試驗確定最佳被檢卵黃抗體作用時間為37℃孵育60 min。

表1 抗原最適包被濃度及陰、陽性Ig Y 最佳稀釋度的確定

表2 最佳包被條件的確定

表3 最佳酶標抗體工作濃度的選擇

表4 一抗最佳反應(yīng)時間的的確定

2.3.5 最佳酶標抗體反應(yīng)時間的確定 最佳酶標抗體作用時間選擇結(jié)果如表5所示。試驗確定最佳酶標抗體作用時間為37℃孵育45 min。

2.3.6 最佳顯色時間的測定 最佳被檢樣品和酶標抗體作用時間選擇結(jié)果如表6所示,最終確定顯色條件為室溫顯色10 min。

2.4 檢測性試驗

2.4.1 特異性試驗 對已知的圓線蟲蟲卵,球蟲卵囊和賈第蟲包囊按照隱孢子蟲檢測的前處理方法,同樣檢測這些蟲卵的抗原作1∶100稀釋,同時設(shè)陽性對照和陰性對照,每份樣品重復(fù)4孔,然后用本試驗建立的間接ELISA 檢測方法進行測定。除陽性對照外,結(jié)果均為陰性,表明Ig Y 抗體間接ELISA方法具有良好的特異性(表7)。

2.4.2 重復(fù)性試驗 如表8結(jié)果所示,隨機抽取的3個卵黃樣品批內(nèi)和批間變異系數(shù)在2.98%～7.58% 之間,均小于10%,表明方法的重復(fù)性好。

2.4.3 敏感性試驗 將陽性Ig Y 作倍比稀釋后,用建立的間接ELISA 方法檢測,結(jié)果顯示當陽性Ig Y稀釋到1∶12 800后,檢測結(jié)果仍為陽性,顯示建立的間接ELISA 方法具有良好的敏感性(表9)。

2.4.4 卵黃抗體的產(chǎn)生規(guī)律 蛋雞在首次免疫后14 d,在卵黃中可以檢測到特異性抗體,經(jīng)過3次免疫之后抗體效價達到1∶12 800(圖1)。

表5 酶標二抗最佳反應(yīng)時間的的確定

表6 最佳顯色時間的確定

表7 特異性試驗

表8 批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗 %

表9 敏感性試驗

圖1 卵黃抗體的產(chǎn)生規(guī)律

3 討論

3.1 IgY抗體比一般哺乳動物來源的IgG 抗體有更多的優(yōu)點禽類與哺乳動物有一定的種屬距離差異,這使得Ig Y 具有很多特性和優(yōu)點[13-14]。Ig Y 具有良好的耐熱、耐酸、耐堿和一定的耐酶解能力;Ig Y 成本低、產(chǎn)量高,易獲得;產(chǎn)蛋母雞易于飼養(yǎng),無須抽取動物的血液,直接收集雞蛋,對動物無傷害,符合動物保護規(guī)則;同時與IgG 相比Ig Y 產(chǎn)生有效抗體反應(yīng)所需抗原量較少,3次免疫后,可以連續(xù)收取雞蛋40 d左右,抗體產(chǎn)出比較高。因此在某些動物疾病的預(yù)防及治療中Ig Y 有著更好的優(yōu)勢,從而被稱為一種新生代抗體,并且已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于各種病原的檢測,疾病的預(yù)防及治療[15-17]。目前對于Ig Y 的規(guī)?；a(chǎn)和臨床推廣應(yīng)用還有一些問題尚未解決,相信隨著Ig Y 生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展和對其研究的不斷深入,Ig Y 的應(yīng)用前景將越來越廣闊,有可能成為一類廣泛應(yīng)用的新型生物制劑。

3.2 建立間接ELISA 方法檢測卵黃抗體水平常用于檢測雞群抗體水平的方法是ELISA、瓊脂擴散、免疫熒光試驗,ELISA 方法具有特異性好,靈敏度高,操作簡便,易標準定量化等優(yōu)點,從而獲得廣泛應(yīng)用[18-19]。在ELISA 反應(yīng)中,非特異性吸附和非特異性反應(yīng)是影響ELISA 方法成敗的關(guān)鍵因素?？乖粷舛取⒁豢瓜♂尡稊?shù)和二抗稀釋倍數(shù)等也直接影響著試驗結(jié)果。通過試驗條件不斷摸索優(yōu)化,最終確定試驗條件為:抗原的工作質(zhì)量濃度為2.5 mg/L;Ig Y 的最佳稀釋倍數(shù)1∶400;Ig Y 作用時間為37℃,1 h;1%明膠37℃封閉1 h;HRP-兔抗雞Ig Y 的最佳工作濃度為1∶5 000,作用時間為37℃,45 min;底物反應(yīng)的時間為室溫顯色10 min。本試驗建立的間接ELISA 特異性強、靈敏度高、可重復(fù)性好。以此方法檢測Ig Y 抗體,首免后7 d開始有抗體產(chǎn)生,三免后7 d測得Ig Y 抗體效價即可達到1∶12 800。

3.3 IgY可進一步應(yīng)用于免疫學(xué)檢測或治療中隱孢子蟲是最常見的人獸共患蟲種之一,主要引起未斷奶犢牛嚴重腹瀉甚至死亡,并可導(dǎo)致包括人在內(nèi)的多種脊椎動物腹瀉[20]。免疫學(xué)檢測方法主要有免疫熒光、酶免疫分析、流式細胞儀技術(shù)、免疫磁珠分離、免疫印跡和間接血凝試驗等,因其特異性好、敏感性強,便于批量檢測等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于隱孢子蟲病診斷中。

目前,國內(nèi)外許多學(xué)者開辟了免疫學(xué)檢測方法檢測隱孢子蟲的新途徑,主要用于檢測隱孢子蟲卵囊抗原,子孢子抗原和特異性抗體,并且有著很好的發(fā)展趨勢和前景[21]。本試驗制得的Ig Y 可以作為捕獲或檢測抗體用來檢測哺乳動物免疫球蛋白,具有更強的特異性和靈敏度,可用于進一步的免疫檢測及治療應(yīng)用中。