王藝凝,周建華,馬麗娜,李學(xué)瑞,劉永生 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州730046)

大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)是腸桿菌科細(xì)菌中最廣泛分布及最常分離的革蘭陰性菌。由于抗生素的廣泛使用,出現(xiàn)了大量的多重耐藥(multidrug resistant,MDR)大腸桿菌,對(duì)人類和動(dòng)物的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅[1-2]。耐藥性廣泛傳播的主要原因是耐藥基因在病原菌和其他細(xì)菌之間的橫向轉(zhuǎn)移,整合子作為耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的主要遺傳元件,是細(xì)菌多重耐藥性形成和廣泛擴(kuò)散的重要原因之一[3]。Ⅰ類整合子作為最廣泛存在的一種整合子,是耐藥基因傳遞的重要載體,可在Ⅰ類整合酶的作用下整合外源基因,使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰?從而影響多重耐藥基因在細(xì)菌間的水平傳播。細(xì)菌的生存狀態(tài)有2種,即浮游及生物被膜狀態(tài),在生物被膜狀態(tài)下,細(xì)菌彼此接觸密切,環(huán)境適應(yīng)能力增強(qiáng),更有利于菌體間基因的水平轉(zhuǎn)移[4],耐藥機(jī)制比浮游狀態(tài)更加錯(cuò)綜復(fù)雜。

外膜蛋白(OMPs)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁特有的結(jié)構(gòu),omp F作為大腸桿菌重要的外膜親水性非特異孔道蛋白之一,與大腸桿菌的耐藥性密切相關(guān)。外膜通透性的改變可以影響抗菌藥物的耐藥機(jī)制,已有研究發(fā)現(xiàn)膜孔蛋白缺失株對(duì)抗生素的敏感性有所降低。目前的研究發(fā)現(xiàn)某些革蘭陰性菌的致病性和耐藥性與生物被膜的形成密切相關(guān)[4],金屬離子、質(zhì)粒、整合子及外膜蛋白的表達(dá)水平可能對(duì)其有一定的影響[5]。因此本研究以Ⅰ類整合酶(intⅠ)為研究對(duì)象,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)分析在生物被膜狀態(tài)下,親本株、omp F基因缺失株和回復(fù)株的Ⅰ類整合酶基因m RNA 的表達(dá)差異,通過(guò)探究omp F基因?qū)Β耦愓厦副磉_(dá)量的影響,探討生物被膜狀態(tài)下耐藥基因水平傳播的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源收集2017年5月－2017年12月從甘肅、青海兩省的500份糞便樣品中分離鑒定的非重復(fù)性大腸桿菌245株,篩選出其中符合本試驗(yàn)條件的菌株N46野生株,此株大腸桿菌Ⅰ類整合酶陽(yáng)性且具有生物被膜形成能力(圖1),對(duì)氨芐西林和氯霉素均敏感(Red同源重組技術(shù)中工具質(zhì)粒的抗性特征),大腸桿菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株。

1.2 質(zhì)粒Red同源重組進(jìn)行基因敲除所需的質(zhì)粒p KD46、p KD3、pCP20由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所李干武研究員贈(zèng)送;質(zhì)粒ps TV28購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(Ta KaRa)。

1.3 主要試劑和儀器細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒均購(gòu)自北京天根生物科技有限公司(TIANGEN);L-阿拉伯糖購(gòu)自Sigma公司,E.ColiTrans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;p MD-18T 載體、PremixTaq酶(ExTaq2.0 Plus)、DL2000 DNA Marker、DpnⅠ,HindⅢ和Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(Ta KaRa);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;qPCR Master Mix熒光定量試劑盒購(gòu)自Vazyme公司,TRIzol購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Real-time PCR System 和電轉(zhuǎn)化儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)根據(jù)篩選出的菌株omp F基因的測(cè)序結(jié)果,利用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)omp F基因重組引物及鑒定引物(表1)。O1/O2用于擴(kuò)增含omp F基因同源臂的氯霉素抗性基因的片段,Omp FF/Omp FR 用于鑒定omp F基因,intⅠF/intⅠR 用于擴(kuò)增Ⅰ類整合酶基因,16S RNA F/16S RNA R,Qint F/Qint R 用 于 熒 光 定 量PCR 擴(kuò)增Ⅰ類整合酶基因。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 N46/omp F 基因缺失株的構(gòu)建和鑒定參照文獻(xiàn)的方法[6],利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌N46omp F基因缺失株。按照常規(guī)方法制備大腸桿菌N46感受態(tài)細(xì)胞[7],將p KD46質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)入大腸桿菌N46 菌株中,構(gòu)建重組菌p KD46/N46。制備p KD46/N46電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。以質(zhì)粒p KD3為模板,O1、O2為引物,通過(guò)PCR 擴(kuò)增含有omp F基因同源臂和氯霉素抗性的打靶DNA 片段,膠回收后用DpnⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,除去體系中未反應(yīng)的p KD3 質(zhì)粒,再將酶切體系進(jìn)行膠回收。將其電轉(zhuǎn)入p KD46/N46感受態(tài)細(xì)胞中,通過(guò)Gam、Bet和Exo 3種λ噬菌體重組酶的作用,進(jìn)行同源重組,產(chǎn)物為N46/omp FΔ。用引物Omp F-F,Omp FR 鑒定,成功后,電轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒,去除氯霉素抗性基因,通過(guò)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序鑒定omp F基因敲除成功。

1.6 N46/omp F 基因回復(fù)株的構(gòu)建和鑒定首先根據(jù)N46野生株omp F基因的測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)含有HindⅢ和Bam HⅠ酶切位點(diǎn)的引物Omp F-N46-F、Omp F-N46-R,PCR 擴(kuò)增出含有啟動(dòng)子的omp F完整片段,膠回收。將目的片段和pSTV28質(zhì)粒分別用HindⅢ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切,用T4連接酶進(jìn)行連接,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中,氯霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆。通過(guò)PCR 擴(kuò)增確定獲得回復(fù)質(zhì)粒。將回復(fù)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入N46/omp FΔ基因缺失株中,經(jīng)氯霉素抗性平板篩選獲得回復(fù)株,通過(guò)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序鑒定omp F基因回復(fù)株構(gòu)建成功。

1.7 大腸桿菌Ⅰ類整合酶基因在生物被膜狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄水平研究

1.7.1 大腸桿菌在浮游及生物被膜狀態(tài)下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 挑取大腸桿菌N46野生株,omp F基因缺失株和回復(fù)株的單菌落接到5 m L LB 液體培養(yǎng)基中,37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,將此菌液作為種子液,按照1∶100的比例加入10 m L LB液體培養(yǎng)基中,37℃200 r/min振蕩培養(yǎng),同時(shí)開始計(jì)時(shí),在未加入種子液前和開始培養(yǎng)的0,1,2,3,4,6,8,10,12,22,24 h分別吸取200μL 菌液置于96孔板中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,測(cè)D600的吸光值,培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)各D值和對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,即為浮游狀態(tài)下的生長(zhǎng)曲線。

根據(jù)生長(zhǎng)曲線,將培養(yǎng)至平臺(tái)期的菌液稀釋至D600為0.01,取200μL加入96孔板中,每株菌接3列24孔,并用LB 液體培養(yǎng)基200μL 接3孔,作為空白對(duì)照,37℃靜置培養(yǎng)。分別在12,24,36,48,60,72,84,96 h取板測(cè)其D600值,培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)各D值和對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,即為生物被膜狀態(tài)下的生長(zhǎng)曲線。

1.7.2 生物被膜狀態(tài)下大腸桿菌RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 將大腸桿菌N46 野生株,omp F基因缺失株和回復(fù)株按照1∶100 的比例加入LB液體培養(yǎng)基中37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,稀釋至D600為0.1,放置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,3 m L/孔,同時(shí)在孔中放入1片滅菌蓋玻片,37℃靜置培養(yǎng)至形成成熟的生物被膜,棄去浮游菌,用生理鹽水清洗,用細(xì)胞刮刮取蓋玻片表面和6孔板表面生物被膜,用生理鹽水將菌體打散,離心備用。用TRIzol法提取細(xì)菌的總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的純度和濃度。取5μL 提取的總RNA 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取RNA 的完整性,－70℃保存?zhèn)溆?。用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司的PrimeScriptTMReverse Transcriptase 試劑盒,將提取的總RNA 經(jīng)二步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.7.3intⅠ和16S RNA PCR 擴(kuò)增 采用25.0μL體系:PremixTaq酶(ExTaq2.0 plus)12.5μL,上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL,c DNA 1.0μL(200 mg/L),dd H20 補(bǔ)足至25.0μL。16S RNA 的擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性90 s;95℃變性40 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,循環(huán)30 次;最后72℃終止延伸5 min。intⅠ的擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,循環(huán)30 次;最后72℃終止延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用含溴化乙錠(EB)的1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.7.4 實(shí)時(shí)定量PCR 分析不同狀態(tài)大腸桿菌intⅠm RNA 的表達(dá)量 以Qint為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的目的基因,16S RNA 為內(nèi)參基因,片段大小分別為110 和218 bp,熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20.0μL,cDNA 模板2.0μL(50 ng),上、下游引物各0.4μL(終濃度10.0μmo L/L),Vazymeq PCR Master Mix 12.5μL,Nuclease-Free Water補(bǔ)足至20.0μL。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃30 s;95℃5 s,60℃30 s,95℃15 s,循環(huán)40次,于退火階段收集熒光信號(hào);最后運(yùn)行熔解曲線分析程序。每組樣本重復(fù)檢測(cè)3～5次。

1.7.5 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用相對(duì)定量(2－△△Ct)法計(jì)算大腸桿菌野生株,omp F基因缺失株和回復(fù)株在生物被膜狀態(tài)下整合酶基因的表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件,采用方差分析對(duì)各組intⅠm RNA 相對(duì)表達(dá)量差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌N46 omp F 基因缺失株的構(gòu)建以p KD3質(zhì)粒為模板,利用引物O1/O2擴(kuò)增出含有氯霉素抗性基因的打靶片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約為1 150 bp,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2),將其電轉(zhuǎn)入含有p KD46質(zhì)粒的N46大腸桿菌中,在含有氯霉素的LB 平板上,37℃過(guò)夜培養(yǎng)后篩選陽(yáng)性克隆,經(jīng)Omp FF/Omp FR 引物鑒定,陽(yáng)性克隆條帶大小為1 122 bp,親本株條帶大小為950 bp(圖3),利用質(zhì)粒p CP20 消除抗性基因,再次使用Omp FF/Omp FR 引物對(duì)抗性消失的克隆進(jìn)行檢測(cè),此時(shí)菌株條帶大小約為200 bp(圖4)。PCR 及測(cè)序結(jié)果表明,氯霉素抗性基因成功去除,獲得N46/omp FΔ基因缺失株。

圖2 打靶片段的擴(kuò)增 M.DL2000 DNA Marker;1～2.PCR 產(chǎn)物;N.陰性對(duì)照

圖3 omp F 和打靶片段重組的結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～2.陽(yáng)性重組子;N.陰性對(duì)照

2.2 大腸桿菌N46 omp F 基因回復(fù)株的構(gòu)建以大腸桿菌N46 的基因組為模板,用Omp F-N46-F和Omp F-N46-R 為引物,PCR 擴(kuò)增出含有啟動(dòng)子的omp F完整片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約為950 bp,與預(yù)期結(jié)果相符(圖5),將構(gòu)建的回復(fù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的缺失株中,挑取的陽(yáng)性克隆,利用引物OF、OR 進(jìn)行鑒定,此時(shí)菌株條帶大小約為1 000 bp(圖6)即為轉(zhuǎn)化成功菌株,命名為N46/omp Fcom基因回復(fù)株。

圖4 Omp F F/Omp F R 鑒定的結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～2.氯霉素抗性去除菌株;3～4.氯霉素抗性未去除菌株;N.陰性對(duì)照

圖5 omp F 基因擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～2.含有啟動(dòng)子的omp F 完整片段;N.陰性對(duì)照

圖6 回復(fù)株鑒定結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～9.陽(yáng)性重組子;N.陰性對(duì)照

2.3 生長(zhǎng)性能的差異比較在浮游狀態(tài)下,omp F基因缺失株相對(duì)于野生株生長(zhǎng)較為緩慢(圖7),達(dá)到平臺(tái)期的D600的值低于野生株,回復(fù)株的生長(zhǎng)速度略有回升,但達(dá)不到野生株的水平。在生物被膜狀態(tài)下(圖8),48 h達(dá)到平臺(tái)期,野生株、缺失株和回復(fù)株基本沒(méi)有生長(zhǎng)差異。

圖7 生長(zhǎng)曲線

圖8 生物被膜形成周期

2.4 RNA質(zhì)量分析在生物被膜狀態(tài)下提取的大腸桿菌N46野生株,omp F基因缺失株和回復(fù)株的總RNA 的A260∶A280在1.8～2.0之間,質(zhì)量濃度均超過(guò)100 mg/L,瓊脂糖凝膠電泳后,凝膠成像分析可見5S,16S和23S 3條明顯的條帶(圖9),提取總RNA 質(zhì)量較好,無(wú)明顯降解。

2.5 mRNA的定性檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄后,分別以16S RNA R 和16S RNA F,intⅠF,intⅠR 為引物進(jìn)行PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定各樣本均有16S RNA(218 bp)和intⅠ(565 bp)表達(dá)(圖10,11),表明各菌株在2 種狀態(tài)下提取的RNA 基本完整且均有intⅠm RNA 轉(zhuǎn)錄。

2.6 intⅠ基因在生物被膜狀態(tài)下mRNA 表達(dá)水平差異比較熒光定量PCR 結(jié)果顯示,大腸桿菌野生株,omp F基因缺失株和回復(fù)株在生物被膜狀態(tài)下的c DNA 的內(nèi)參基因16S RNA 和intⅠ均得到有效擴(kuò)增(圖12,13),有明顯的指數(shù)期和平臺(tái)期,熔解曲線形成單一峰,無(wú)非特異性峰出現(xiàn),說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。根據(jù)16S RNA 和intⅠ的Ct 值,應(yīng)用相對(duì)定量法(2－△△Ct)分別計(jì)算N46野生株,

omp F基因缺失株和回復(fù)株在生物被膜狀態(tài)下intⅠ表達(dá)量。結(jié)果顯示,在生物被膜狀態(tài)下omp F基因缺失株intⅠ基因的表達(dá)水平比野生株明顯降低,回復(fù)株的表達(dá)水平會(huì)有所升高,但回復(fù)不到野生株的表達(dá)水平(表2)。

圖9 總RNA 提取電泳圖 1.野生株;2.缺失株;3.回復(fù)株

圖10 cDNA 16S RNA PCR 電泳圖 M.DL2000 DNA Marker;1.野生株;2.缺失株;3.回復(fù)株

圖11 cDNA intⅠPCR 電泳圖 M.DL2000 DNA Marker;1.野生株;2.缺失株;3.回復(fù)株

3 討論

大腸桿菌作為一種條件性致病菌,分布廣泛,能夠引起人和動(dòng)物全身性疾病。隨著規(guī)?；?集約化畜牧業(yè)的發(fā)展,大腸桿菌病已經(jīng)成為危害中國(guó)畜牧業(yè)的主要傳染病之一,給畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其隨著抗生素的濫用,使大腸桿菌耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為全世界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。但由于耐藥機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,獲得耐藥性的速度越來(lái)越快,對(duì)臨床目前使用的藥物廣泛耐藥已成為治療的難題。

圖12 intⅠ熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增曲線

圖13 intⅠ熒光定量RT-PCR 熔解曲線

表2 各菌株intⅠm RNA 相對(duì)表達(dá)結(jié)果

細(xì)菌的生物被膜是其為適應(yīng)環(huán)境而形成的菌落聚集物,由多糖蛋白等復(fù)合物將細(xì)菌包裹其中而形成的膜樣結(jié)構(gòu)。細(xì)菌形成生物被膜后,由于其特殊的結(jié)構(gòu),耐藥性會(huì)發(fā)生一定程度的改變。有研究發(fā)現(xiàn),某些能形成生物被膜的革蘭陰性菌的耐藥率顯著高于不能形成生物被膜的菌株[8],一些基因的表達(dá)水平和質(zhì)粒傳遞效率與浮游狀態(tài)相比也有所變化,LARISSA 等[9]發(fā)現(xiàn)生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌質(zhì)粒的傳遞效率比浮游狀態(tài)高,還有研究發(fā)現(xiàn)生物被膜狀態(tài)下很多蛋白的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)不同程度的上調(diào)和下降[10]。

對(duì)于Ⅰ類整合酶的研究雖然已經(jīng)從最初的檢測(cè)階段進(jìn)入到了研究其影響機(jī)制方面,但依舊鮮少研究報(bào)道。人們只知道rec A基因可以通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)影響Ⅰ類整合酶基因的表達(dá)[11-12],omp F基因作為抗生素進(jìn)入細(xì)胞的主要通道,它對(duì)耐藥基因的轉(zhuǎn)移是否也有影響,目前尚無(wú)報(bào)道。

本試驗(yàn)以耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移為出發(fā)點(diǎn),研究了omp F基因?qū)Υ竽c桿菌I類整合酶基因在生物被膜狀態(tài)下表達(dá)量的影響,我們發(fā)現(xiàn)在生物被膜狀態(tài)下omp F基因缺失株intⅠ基因的表達(dá)水平比野生株明顯降低,回復(fù)株的表達(dá)水平會(huì)有所升高,但仍回復(fù)不到野生株的表達(dá)水平。原因可能有以下幾個(gè):(1)外膜蛋白是小分子親水物質(zhì)出入細(xì)菌的通道,對(duì)生物被膜的形成有一定的影響[13],所以由于omp F基因的缺失,大腸桿菌形成生物被膜后,抗生素進(jìn)入細(xì)菌的數(shù)量減少,Ⅰ類整合酶基因的表達(dá)水平會(huì)顯著下降,影響細(xì)菌進(jìn)行密集接觸并獲得和傳遞耐藥基因盒,降低整合酶對(duì)耐藥基因的捕獲概率。(2)生物被膜內(nèi)的細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌一些小分子信號(hào)到周圍環(huán)境中,當(dāng)它們的濃度達(dá)到一定程度,就會(huì)調(diào)節(jié)某些基因表達(dá),使某些細(xì)菌的基因水平轉(zhuǎn)移和DNA 合成更頻繁。但由于omp F基因的缺失,小分子出入細(xì)菌通道被破壞,所以降低了基因的水平轉(zhuǎn)移和DNA 合成。(3)通過(guò)生長(zhǎng)曲線可以看出,雖然omp F基因不是大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的必需功能性基因,敲除該基因不會(huì)導(dǎo)致菌株的死亡,但會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)有一定的影響。所以其基因回復(fù)株雖然能使其Ⅰ類整合酶的表達(dá)水平有所升高,但不能回復(fù)到野生株的表達(dá)水平。

綜上所述,生物被膜的形成與外膜蛋白密切相關(guān),本研究中生物被膜的狀態(tài)是其成熟的生物被膜狀態(tài),但生物被膜的形成過(guò)程比較復(fù)雜,在其形成的不同階段,基因的表達(dá)水平也發(fā)生著一定的變化,所以omp F基因在生物被膜形成的不同階段對(duì)Ⅰ類整合酶基因的表達(dá)的影響有待于進(jìn)一步的探討。此外,由于生物被膜是很多抗生素進(jìn)入細(xì)菌的主要通道,所以在不同抗菌藥物壓力下,Ⅰ類整合酶基因的m RNA 轉(zhuǎn)錄水平是否存在差異仍有待研究。