王 亨,周鈺奇,畢崇亮,祝啟成,崔璐瑩,孟 霞,朱國強,李建基? (1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚州225009;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州225009;.臨沂大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)學(xué)院,山東 臨沂276005)

奶牛乳腺炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病,常導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降[1-2]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是重要的病原體之一[3-4],可以在細胞內(nèi)復(fù)制,導(dǎo)致持續(xù)感染,引起亞臨床慢性乳腺炎[5]。自噬是細胞內(nèi)重要的降解機制,能夠降解代謝營養(yǎng)素或不必要的細胞質(zhì)成分,維持ATP產(chǎn)生和大分子合成,并通過選擇性自噬參與消除入侵的致病生物[6]。然而,部分細菌環(huán)境適應(yīng)性進化,能夠干擾自噬,逃避消除作用。SCHNAITH 等[7]發(fā)現(xiàn)S.aureus在侵襲Hela細胞時,能抑制自噬體成熟,阻止其與溶酶體融合,最終S.aureus從自噬體逃逸進入細胞質(zhì)。NEUMANN等[8]研 究 表 明S.aureus能 通 過MAPK14/p38a MAP激酶介導(dǎo)的自噬阻斷,避開噬菌體并阻止其進一步降解。

硒是哺乳動物必需的微量元素,對動物機體免疫功能及炎癥反應(yīng)具有顯著的調(diào)控作用[9]。研究發(fā)現(xiàn),在日糧添加硒能夠增強吞噬細胞活性并降低乳腺炎風險[10]。在奶牛乳腺感染試驗中發(fā)現(xiàn),缺硒組乳腺組織病變和壞死的程度均嚴重于補硒組[11]。另外硒對細胞自噬也有一定影響。SONG 等[12]研究發(fā)現(xiàn),補充硒能夠緩解AD 小鼠自噬功能障礙,降低p62水平,促進底物降解,增強自噬的清除作用。硒在乳腺對病原菌的免疫防御過程中發(fā)揮著重要的作用,但是其在影響自噬,增強細胞對細菌的抵抗方面的研究尚未見報道?；诖?本試驗對硒在S.aureus誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)自噬及胞內(nèi)細菌增殖的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料原代BMECs由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院外科實驗室分離培養(yǎng)鑒定并保存。S.aureus(ATCC 29213),購自美國典型菌種保存中心。

1.2 主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶和溶葡萄球菌酶購自美國Sigma公司;胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;RAPI裂解液和蛋白酶抑制劑購于北京普利萊公司。BCA 蛋白濃度測定試劑盒和DAPI染液購于北京碧云天公司。兔抗βactin、Beclin-1、p62/SQSTM1和Atg5一抗,以及山羊抗兔二抗均購于美國CST 公司。鼠抗LC3以及山羊抗鼠二抗購于日本MBL 公司。亞硒酸鈉購于國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原代BMECs的分離培養(yǎng) 從健康的泌乳荷斯坦奶牛無菌采集乳腺組織,用含有300 IU 雙抗的PBS沖洗,除去乳汁和血液。將樣品低溫下帶回實驗室進一步處理。用PBS沖洗乳腺組織并收集腺泡于燒杯中,然后用眼科剪將乳腺腺泡剪切成糊狀(約1 mm3)。加入DMEM/F12培養(yǎng)液以懸浮并洗滌組織塊,直至懸浮液澄清。離心后,加入Ⅱ型膠原酶,將其置于37℃CO2培養(yǎng)箱中消化2～3 h。使用20和80目濾網(wǎng)過濾細胞懸浮液,收集細胞并重懸于含有15%FBS和100 IU 雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中,將其接種在25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃,5%CO2下培養(yǎng)。當細胞長至80%時,通過細胞對胰蛋白酶敏感的差異純化細胞。

1.3.2S.aureus的 培 養(yǎng) 細 菌 培 養(yǎng) 于Luria-Bertani固體和液體培養(yǎng)基中。通過測量D600監(jiān)測細菌生長。當S.aureus長至對數(shù)生長期時,收集細菌,離心、洗滌,用DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度用于試驗。

1.3.3S.aureus胞內(nèi)感染原代BMECs模型 將細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中,待細胞80%以上匯合后將對數(shù)生長期的S.aureus稀釋,并按MOI＝1∶1處理細胞1.5 h。然后用溶葡萄球菌酶(10 mg/L)處理細胞12 min,殺死細胞外細菌,之后更換DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),建立胞內(nèi)感染模型[8,13]。

1.3.4 Western blot 法 檢 測 硒 對S.aureus誘 導(dǎo)BMECs自噬相關(guān)蛋白的影響 將細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中,待細胞70%以上匯合,分別加入2,4,8μmol/L 的亞硒酸鈉作為3個試驗組,并設(shè)立空白組和陽性對照組(S.aureus感染組)。硒預(yù)孵12 h后,按1.3.3方法建立胞內(nèi)感染模型,更換DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h。用預(yù)冷的PBS清洗細胞3次,加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液。4℃裂解30 min后,將其置于4℃水平離心機,12 000 r/min離心10 min,收集上清,并用BCA 蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。按3∶1加入4×上樣緩沖液,沸水浴10 min,瞬離后進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜。根據(jù)抗體使用說明對轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素膜分別進行脫脂乳封閉,以及一抗、二抗孵育,最后加入ECL發(fā)光液于顯影成像儀中進行顯影,并計算其灰度值。

1.3.5 GFP-LC3與溶酶體標志物的共定位檢測 將細胞接種于含細胞爬片的24 孔板中,待細胞匯合70%后,按照Lipofectamine2000使用說明對細胞進行GFP-LC3轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12 h,對細胞進行相應(yīng)處理。設(shè)立空白組、S.aureus胞內(nèi)感染組、亞硒酸鈉組以及亞硒酸鈉預(yù)孵S.aureus處理組。其中S.aureus感染時間為3 h,亞硒酸鈉濃度為8μmol/L。于固定細胞前1 h 在各組中加入Lyso-Tracker對溶酶體進行標記,并避光。4%多聚甲醛固定爬片后,PBS清洗3次,加入DAPI進行核復(fù)染,15 min后,PBS清洗3次,封片并于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.6 平板計數(shù)法檢測硒對S.aureus在BMECs胞內(nèi)增殖的影響 將細胞接種于培養(yǎng)皿,待細胞匯合70%以上,分別加入0,2,4,8μmol/L 的亞硒酸鈉,孵育12 h,將S.aureus以MOI＝1∶1加入各組細胞。共培養(yǎng)1.5 h,用10 mg/L溶葡萄球菌酶處理細胞12 min,清除胞外菌。然后用PBS洗滌細胞3次。3 h后收集樣品,用0.5%Triton X-100裂解30 min。通過細菌平板計數(shù)檢測細胞內(nèi)細菌數(shù)。

1.3.7 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)進行單因素方差分析(ANOVA),采用LSD 檢驗及Dunnett法作組間均值比較。數(shù)據(jù)以表示,?表示差異顯著(P＜0.05),??表示差異極顯著(P＜0.01)。

2 結(jié)果

2.1 硒對S.aureus 誘導(dǎo)BMECs自噬的影響采用Western blot法檢測硒對S.aureus誘導(dǎo)的原代BMECs自噬相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當S.aureus感染BMECs 后,自噬相關(guān)蛋白如LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1和p62蛋白表達均極顯著高于空白對照組(P＜0.01);而當采用硒進行干預(yù)后,試驗組LC3-Ⅱ和p62蛋白表達與陽性對照組相比,開始降低,4和8μmol/L試驗組出現(xiàn)顯著性或者極顯著性下降(P＜0.05或P＜0.01),且呈劑量依賴性(圖1 A～B)。

圖1 硒對S.aureus 感染的BMECs 自噬相關(guān)蛋白表達的影響 Con.空白對照組;＋.S.aureus 胞內(nèi)感染組;1.2μmol/L Na2 SeO 3;2.4μmol/L Na2 SeO3;3.8μmol/L Na2 SeO3;與空白對照組比較,?P＜0.05,??P＜0.01;與S.aureus 單獨處理組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。下同

2.2 GFP-LC3與溶酶體的融合檢測結(jié)果通過對自噬體和溶酶體標記的共定位檢測自噬體和溶酶體的融合。結(jié)果顯示,S.aureus感染BMECs后,細胞內(nèi)觀察到明顯的綠熒光色,但是綠色聚點與Lyso-Tracker紅色斑點并無明顯的共定位現(xiàn)象;而當采用硒處理后,綠色GFP-LC3熒光聚點與紅色熒光標記的溶酶體出現(xiàn)部分重合,呈桔黃色(圖2),說明硒處理后促進了自噬溶酶體的形成。

圖2 GFP-LC3與溶酶體的共定位觀察(bar＝10μm)

2.3 硒對S.aureus 在BMECs胞內(nèi)增殖的影響采用細菌平板計數(shù)檢測硒對S.aureus在BMECs的胞內(nèi)增殖影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加硒后,隨著硒濃度的升高,S.aureus胞內(nèi)增殖數(shù)量依次下降,并具有劑量依賴性,且與對照組相比,差異顯著(P＜0.01)(圖3),說明添加硒可以降低S.aureus在BMECs中的增殖。

圖3 硒對BMECs中S.aureus胞內(nèi)增殖的影響 1.2μmol/L Na2 SeO3;2.4μmol/L Na2 SeO3;3.8μmol/L Na2 SeO3;與對照組比較,?P＜0.05,??P＜0.01

3 討論

S.aureus是引起奶牛乳腺炎的一種常見致病菌,常引發(fā)臨床和亞臨床乳腺炎,發(fā)病率高,嚴重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)。S.aureus入侵細胞后通過釋放毒素和促炎因子誘導(dǎo)炎癥和細胞毒性作用[14]。自噬是細胞內(nèi)重要的降解機制,通過吞噬自身細胞質(zhì)蛋白、細胞器或病原微生物,并與溶酶體融合,形成自噬溶酶體,降解其內(nèi)含物,實現(xiàn)自身的代謝或某些細胞器的更新。研究發(fā)現(xiàn),部分病原微生物能夠在自噬中逃逸或者利用自噬在宿主細胞中存活和繁殖。SCHNAITH 等[7]研究發(fā)現(xiàn),表達黏附作用相關(guān)因子如agr的S.aureus能夠抑制自噬體成熟,而這有利于S.aureus從自噬體逃逸至細胞質(zhì)中,進而導(dǎo)致宿主細胞死亡。MARIA 等[15]發(fā)現(xiàn)S.aureus分泌的α-溶血素能誘導(dǎo)細胞自噬,但是由毒素誘導(dǎo)的自噬囊泡無法與溶酶體正常融合。LC3是自噬的關(guān)鍵蛋白質(zhì),LC3-Ⅱ可以穩(wěn)定地存在于自噬體的內(nèi)膜和外膜上,直至形成自噬溶酶體,故LC3常用于標記和追蹤自噬體[16]。p62 是一種選擇性自噬接頭蛋白,可以捕獲泛素化蛋白和病原體,參與選擇性自噬[17]。p62通常用于檢測細胞內(nèi)自噬流,其蛋白表達水平與自噬流呈負相關(guān)[18]。在本次試驗中發(fā)現(xiàn),S.aureus感染BMECs后,細胞內(nèi)LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1以及p62蛋白水平顯著升高,說明當S.aureus感染BMECs后,促進了自噬體的形成,但是自噬體的降解受到了抑制,細胞代謝發(fā)生紊亂。通過GFP-LC3與溶酶體標記物的共定位進一步發(fā)現(xiàn),S.aureus誘導(dǎo)BMECs自噬時,GFP-LC3與溶酶體標記物未發(fā)現(xiàn)明顯的融合共定位,同時p62蛋白表達升高,說明自噬體與溶酶體在感染的過程中,融合受到影響,自噬流受阻,自噬體的調(diào)節(jié)降解功能受阻,而這可能是S.aureus在臨床上常引起持續(xù)慢性感染的原因之一。

硒是一種哺乳動物必需的微量元素,參與機體抗氧化應(yīng)激、炎癥等進程。硒也常用于預(yù)防和治療奶牛乳腺炎。MALBE 等[19]研究發(fā)現(xiàn),通過補充硒,能夠提高奶牛血液谷胱甘肽過氧化物酶活性,抑制乳清中S.aureus的生長。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)硒通過抑制TLR2、NF-κB和MAPK 信號通路的激活,改善S.aureus誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)[13]。此外,硒能夠提高吞噬細胞活性,增強對病原體的吞噬作用。ARIBI等[20]發(fā)現(xiàn)硒能夠增強巨噬細胞活性,增強對S.aureus的殺傷力。硒還能通過抑制氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)自噬,影響病原體的復(fù)制[21]。本試驗中發(fā)現(xiàn),硒能夠降低S.aureus感染引起的BMECs中LC3-Ⅱ和p62的升高,且呈濃度依賴型。在GFP-LC3與溶酶體標記物的共定位中,發(fā)現(xiàn)硒處理后,感染組內(nèi)綠色LC3聚點與溶酶體紅色標記存在明顯共定位現(xiàn)象,且胞內(nèi)S.aureus的數(shù)量顯著低于S.aureus單獨處理組,呈劑量依賴,說明硒可以促進S.aureus誘導(dǎo)的BMECs自噬體與溶酶體的融合,并改善自噬流的通暢程度,降低了S.aureus在胞內(nèi)的存活,有利于該細菌的清除。

綜上所述,S.aureus感染BMECs,可誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生,但自噬體與溶酶體的結(jié)合和自噬流受阻。添加硒后,能夠促進自噬體和溶酶體的結(jié)合,改善自噬流的通暢程度,降低細菌的胞內(nèi)存活,從而參與調(diào)節(jié)和改善S.aureus感染BMECs的進程,為臨床金黃色葡萄球菌性乳腺炎的預(yù)防和治療提供了新思路。