孫 雯,張瑩輝,曹 雨,朱 真,杜吉革,李啟紅,陳小云,姚文生,錢鶯娟,印春生?

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京210095)

藍(lán)舌病(bluetongue,BT)是由藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus,BTV)引起的傳播于綿羊、山羊、牛等反芻動物之間的傳染病。BTV 主要通過庫蠓對反芻動物的叮咬傳播,被感染動物通過水平傳播感染其他反芻動物或通過胎盤屏障進(jìn)行垂直傳播。BT 被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告的動物疫病,在我國將其列為一類疫病,作為發(fā)現(xiàn)必須申報的動物傳染病[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的BTV 有27種不同血清型,不同血清型之間無交叉保護(hù)作用,不同血清型致病力不同,感染反芻動物的臨床癥狀表現(xiàn)差異明顯[2]。目前,在對國內(nèi)29個省區(qū)進(jìn)行BTV 血清病學(xué)調(diào)查中,檢測出BTV1～4、BTV12、BTV15、BTV16等7個血清型,其中BTV1和BTV16為主要致病血清型[3]。BTV14最早在非洲國家發(fā)現(xiàn),并在熱帶地區(qū)傳播。2011 年,BTV14 首次在歐洲的俄羅斯被發(fā)現(xiàn),隨后相繼在立陶宛,西班牙等國出現(xiàn)。2012年,在波蘭政府的監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)了BTV14,而波蘭在此前從未發(fā)現(xiàn)BTV。經(jīng)過同源性比對分析發(fā)現(xiàn),在歐洲地區(qū)流行的BTV14 與南非的BTV14疫苗毒株高度同源[4],可表明BTV14有由熱帶向高緯度地區(qū)擴(kuò)散的趨勢。我國目前雖然還未有BTV14出現(xiàn)的相關(guān)報道,但是隨著國際貿(mào)易往來的頻繁和全球氣候的變化,BTV14傳入我國的風(fēng)險變大。雖然BTV14 本身致病性不高,但是從波蘭監(jiān)測BTV 的經(jīng)驗來看,BTV14可作為監(jiān)測BTV傳播趨勢的指示[5]。因此,有必要做好BTV14的相關(guān)檢疫監(jiān)測工作。

BTV 屬于呼腸孤病毒科,環(huán)狀病毒屬藍(lán)舌病病毒亞群(bluetongue virus subgroup)。呼腸孤病毒(reoviridae)的共同特征是其基因組都為由10到12條線性雙鏈RNA 組成[6],共編碼5種非結(jié)構(gòu)蛋白NSl～NS4、NS3a和7 種結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP7[7]。其中VP7蛋白也為BTV 核心蛋白,占內(nèi)衣殼蛋白的36%[8]。VP7具有群特異性抗原決定位點,為主要血清群特異性抗原。因為VP7蛋白序列高度保守且能刺激被感機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的群特異性免疫反應(yīng)。所以VP7蛋白是用于建立BTV 群特異性血清學(xué)檢測方法的最佳選擇[9]。BTV 的VP7蛋白為高度保守蛋白,不同血清型之間的同源性高達(dá)94%。VP7蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,可用于建立BTV 特異性血清學(xué)檢測方法,也可作為檢測BTV 抗體的抗原[10]。所以選用VP7蛋白建立特異性血清學(xué)診斷方法。本研究應(yīng)用p ET-32a為表達(dá)載體,對群特異性VP7蛋白進(jìn)行原核表達(dá)及純化,運(yùn)用ELISA 方法鑒定其免疫原性,為后續(xù)方法建立及單克隆抗體制備提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料14型BTV 由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離鑒定和保存;p ET-32a原核表達(dá)載體、Vero細(xì)胞均為本試驗室保存;大腸桿菌高質(zhì)?？截惥闐H5α和蛋白表達(dá)菌株Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自大連寶生物公司。

1.2 主要試劑KOD 高保真DNA 聚合酶購自日本TOYOBO 公司,Bam H I、XhoⅠ等限制性內(nèi)切酶、DNA T4連接酶購自NEB 公司,DNA Marker,蛋白Marker為大連寶生物公司產(chǎn)品,病毒RNA 提取試劑盒,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,膠回收試劑盒,質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek 公司,IPTG 購自天根生物有限公司,考馬斯亮藍(lán)購自上海生工生物工程。

1.3 s 7基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 中的BTV14的s7基因(KY092033.1),利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,引物由上海生工生物公司合成,設(shè)計的引物如下(表1):

表1 擴(kuò)增VP7基因引物

1.3.2 病毒RNA 的提取及s7基因的擴(kuò)增 利用OMEGA 病毒RNA 提取試劑盒對感染14型BTV的Vero 細(xì)胞進(jìn)行RNA 提取,利用下游引物BTV14-VP7-R/XhoⅠ反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板對VP7 基因進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:94℃2 min;98℃10 s;50℃30 s;68℃45 s;68℃5 min;33個循環(huán)。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后,配制1%核酸膠進(jìn)行凝膠電泳鑒定,并進(jìn)行膠回收。

1.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 對擴(kuò)增后膠回收的s7片段和載體pET-32a分別進(jìn)行Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回試劑盒,使用T4DNA Ligase進(jìn)行連接,反應(yīng)時間為12 h,反應(yīng)溫度為16℃。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于Amp 抗性的LB 平板上,37℃培養(yǎng)過夜,挑取平板上的單菌落,37℃搖菌培養(yǎng)12～14 h,利用OMEGA 質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。將質(zhì)粒送中美泰和生物公司進(jìn)行測序。將測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為p ET-32a-VP7。

1.4 VP7 蛋白的表達(dá)及鑒定將構(gòu)建好的質(zhì)粒p ET-32a-VP7和空載體p ET-32a分別轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)菌株Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。表達(dá)誘導(dǎo)方法:在第1天晚上9:00左右接種到具有Amp抗性LB培養(yǎng)基中,置于搖床上,37℃,250 r/min 過夜。次日上午9:00 按照1∶100 轉(zhuǎn)接于新的含Amp抗性50 m L LB培養(yǎng)基的錐形瓶中,置于搖床上,37℃,250 r/min,4～6 h,取100 μL 菌 液 測D600nm值,直到D600nm值達(dá)到0.5～0.6即可取出錐形瓶,先取出1 m L菌液作為未誘導(dǎo)對照,再加入確定終濃度的誘導(dǎo)劑IPTG,在合適的誘導(dǎo)溫度下繼續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌液,將未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后菌液均離心后棄去上清培養(yǎng)基,加入無菌PBS重懸沉淀,進(jìn)行超聲波裂解,直至溶液清亮,10 000 r/min,離心5 min,分別收集包涵體沉淀和裂解上清。SDS-PAGE電泳進(jìn)行可溶性分析鑒定。并對表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)印,利用HIS 標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行Western blot鑒定。

1.5 VP7表達(dá)蛋白的純化及鑒定大量誘導(dǎo)表達(dá)BTV14的VP7蛋白。原核表達(dá)載體p ET-32a自身帶有的His標(biāo)簽是重組VP7蛋白的識別標(biāo)簽,使用鎳柱進(jìn)行表達(dá)蛋白的純化,目的蛋白能與鎳離子結(jié)合,其他雜蛋白通過洗滌液與目的蛋白分離,去除雜蛋白,最后通過含有咪唑洗脫液,將目的蛋白從鎳離子柱上洗脫下來,得到純化后的VP7蛋白。對純化后的蛋白使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度定量測定,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)行可溶性分析鑒定和Western blot鑒定。通過SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果分析可知重組蛋白VP7在經(jīng)過優(yōu)化誘導(dǎo)溫度后,仍以包涵體形式存在于菌體中,所選用含有尿素的緩沖液先對菌體沉淀進(jìn)行變性和復(fù)性。再將復(fù)性后的菌體蛋白進(jìn)行純化,并進(jìn)行Western blot鑒定。

1.6 間接ELISA檢測方法的建立

1.6.1 抗血清的制備 復(fù)蘇Vero 細(xì)胞,按照10 MOI病毒量大量擴(kuò)增病毒,收集病毒上清500 m L。將收集的500 m L 病毒上清進(jìn)行濃縮,濃縮后的病毒置于15%～60%濃度的蔗糖中,進(jìn)行蔗糖密度梯度離心純化病毒,用分光光度儀測定純化后蛋白含量。將病毒與等體積弗氏佐劑混合形成油包水的乳糜狀,按照每只山羊免疫1 g蛋白,每隔2周加強(qiáng)免疫1次,加強(qiáng)免疫時采用不完全弗氏佐劑與病毒等體積混勻。從第3次免疫開始,每次免疫后1周對免疫羊進(jìn)行頸靜脈采血,分離血清,分裝后儲存于－20℃。分離血清后,使用表達(dá)制備的VP7蛋白作為包被抗原,利用間接ELISA 檢測血清中VP7蛋白的抗體效價。

1.6.2 間接ELISA 方法建立 本試驗用間接ELISA 方法檢測羊高免血清中所含VP7抗體的效價,將純化后的VP7蛋白作為抗原包被于固相載體上,1.6.1中制備的羊高免血清抗體與抗原結(jié)合。通過洗板去除未結(jié)合物,再加入HRP 標(biāo)記的兔抗羊酶標(biāo)抗體,最后通過加入能與酶反應(yīng)的底物顯色,通過讀取D450nm值進(jìn)行定量判斷。

抗原最佳包被濃度及抗體最佳稀釋比例的確定:應(yīng)用棋盤滴定法,將1 mg純化后VP7蛋白抗原按照1 ∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600 的稀釋度包被到酶標(biāo)板中,每孔100μL;將陽性和陰性血清同樣進(jìn)行倍比稀釋,分別為1∶10,1∶20,1∶40,1∶80,1∶160,1∶320,1∶640,1∶1 280 稀釋倍數(shù),每孔100μL 加入酶標(biāo)板。操作步驟按照常規(guī)間接ELISA 方法進(jìn)行。

酶標(biāo)二抗稀釋度優(yōu)化:將HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG 酶標(biāo)抗體用PBST 進(jìn)行1∶1 000,1∶3 000,1∶5 000,1∶10 000,1∶20 000 共5 個稀釋度稀釋。根據(jù)間接ELISA 試驗結(jié)果確定酶標(biāo)抗體的最佳使用濃度。

底物顯色時間優(yōu)化:使用TMB 底物避光顯色5,10,15和20 min。根據(jù)間接ELISA 試驗結(jié)果選擇最佳底物作用時間。

判定標(biāo)準(zhǔn)確定:取無BTV 免疫史和感染史的30份健康羊血清,用已建立的間接ELISA 方法進(jìn)行試驗,讀取D450nm值,計算出30 份陰性血清的D450nm值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤計算出臨界值(陰陽性臨界值)。當(dāng)樣品血清的D450nm大于時,判定為陽性,當(dāng)樣品血清D450nm小于等于時,可判定為陰性。

1.6.3 間接ELISA 方法的敏感性和特異性鑒定 敏感性試驗:已知的80份血清進(jìn)行倍比稀釋,同時進(jìn)行中和抗體檢測(VN)和間接ELISA 方法檢測,根據(jù)陰陽性臨界值比較2種方法能檢測到的陽性血清數(shù)量,判斷建立ELISA 方法的敏感性。

特異性試驗:使用已經(jīng)建立的間接ELISA 同時檢測2份羊痘陽性血清,2份羊口蹄疫陽性血清和2份羊的小反芻獸疫陽性血清,每份血清做3個平行重復(fù),并設(shè)置陽性、陰性血清對照,確定該方法的特異性。

2 結(jié)果

2.1 s 7基因的擴(kuò)增以BTV14型的cDNA 為模版,BTV14-VP7-F和BTV14-VP7-R為上、下游引物,擴(kuò)增出s7全長基因片段,大小為1 050 bp(圖1)。

圖1 s7 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.s7基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-32a-VP7 的構(gòu)建用Bam HⅠ和XhoⅠ對目的片段進(jìn)行雙酶切后連接于酶切后的pET-32a載體上,對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定正確后送測序,測序結(jié)果正確。p ET-32a-VP7構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 pET-32a-VP7 雙酶切鑒定結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.s7基因擴(kuò)增產(chǎn)物;2.p ET-32a-VP7雙酶切產(chǎn)物;3.p ET-32a-VP7雙酶切產(chǎn)物

2.3 VP7蛋白的表達(dá)及可溶性分析將收集到的包涵體沉淀和裂解上清,經(jīng)Western blot分析,結(jié)果顯示上清和包涵體中均獲得清晰的目的條帶(圖3),結(jié)果表明VP7蛋白能夠與HIS標(biāo)簽融合表達(dá)。

2.4 VP7蛋白的純化通過SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果可知,目的蛋白VP7以包涵體形式存在于菌體中,所選用含有尿素的緩沖液對菌體沉淀進(jìn)行純化。對純化后的蛋白使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度定量測定。并對純化后的蛋白進(jìn)行可溶性分析和Western blot分析。結(jié)果顯示純化后的蛋白無明顯雜蛋白,獲得清晰的目的條帶(圖4,5)。

圖3 VP7 的Western blot檢測 M.蛋白Marker;1.pET-32a-VP7裂解上清;2.pET-32a-VP7包涵體沉淀

圖4 純化后VP7蛋白SDS-PAGE 分析 M.蛋白Marker;1.p ET-32a-VP7純化后蛋白

圖5 純化后VP7蛋白Western blot分析 M.蛋白Marker;1.p ET-32a-VP7純化后蛋白

2.5 間接ELISA最佳工作條件確定根據(jù)正交矩陣滴定結(jié)果,當(dāng)VP7 蛋白稀釋度達(dá)到1∶400(1.25 g/m L)時,羊血清稀釋達(dá)到1∶320時,陽性血清D450nm值大于1,陰性血清D450nm值小于0.2,且P/N值為8.07;分別以不同的封閉系統(tǒng)對包被的VP7蛋白進(jìn)行封閉,從結(jié)果可得出,利用PBST稀釋的5% BSA 作為封閉液時,陽性血清值大于1.0,陰性血清值小于0.2,且P/N值較高;將HRP-兔抗羊IgG 的酶標(biāo)抗體進(jìn)行不同濃度的稀釋,測定P/N比值,根據(jù)結(jié)果確定酶標(biāo)抗體最佳稀釋濃度為1∶10 000。

ELISA 臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)確定:對30 份健康羊陰性血清,用已建立的間接ELISA 方法進(jìn)行檢測,讀取D450nm值,計算出30份陰性血清D450nm值的平均值為0.128 3和標(biāo)準(zhǔn)誤為0.029 4,因此陰陽性臨界值為0.215 6(表2)。

表2 30份BTV 陰性血清的D 450 nm平均值

2.6 特異性試驗使用已經(jīng)建立好的間接ELISA同時檢測2份羊痘陽性血清,2份羊口蹄疫陽性血清和2份羊的小反芻獸疫陽性血清,每份血清做3個平行重復(fù),并設(shè)置陽性、陰性血清對照,根據(jù)檢測得到的平均值和陰陽血清臨界值對比,當(dāng)小于臨界值0.215 6 時,判定其為陰性,說明BTV 重組蛋白VP7與常見的羊病毒血清無交叉反應(yīng),建立ELISA方法具有良好的特異性(表3)。

表3 BTV 間接ELISA 檢測方法的特異性分析

2.7 敏感性試驗用所建立的間接ELISA 方法,和病毒血清中和試驗(VN)同時檢測80份實驗室保存待檢血清樣品,病毒血清中和試驗共檢測出陽性66份,間接ELISA 共檢測出陽性69份,2種方法檢測結(jié)果相同的樣品共有72份,符合率達(dá)到90%,這說明建立的間接ELISA方法具有良好的準(zhǔn)確性(表4)。

表4 間接ELISA 與病毒血清中和試驗的結(jié)果比對 份

2.8 多克隆抗體效價檢測利用已建立的針對羊血清的VP7間接ELISA 方法,對5只免疫羊血清抗體效價進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果得到2,3和5號羊的抗體效價較高,最高效價達(dá)到1∶8 192,因此選擇這3只羊作為抗體純化的血清(圖6)。

圖6 VP7多克隆抗體效價

3 討論

藍(lán)舌病是在常見家養(yǎng)和野生反芻動物間高度傳染的一種疾病,其病原血清型眾多且不同血清型的BTV 引起的臨床病理特征差異巨大[11]。BTV 是該病的病原,其基因組編碼的7種結(jié)構(gòu)蛋白一直是研究基因工程疫苗和診斷方法的重點,VP7 蛋白是BTV 內(nèi)衣殼的1個主要結(jié)構(gòu)蛋白,占內(nèi)衣殼蛋白的36%,具有群特異性抗原決定位點,對于病毒的復(fù)制和傳播具有重要意義[12]。不同血清型BTV 的VP7蛋白同源性高達(dá)99%,VP7至少有2個表位暴露在病毒粒子表面,利用重組VP7蛋白對動物體內(nèi)的抗體水平進(jìn)行監(jiān)測,目前對于檢測和診斷BTV 來說,VP7蛋白是建立BTV 群特異性血清學(xué)檢測方法的最佳選擇[1]。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),具有時間短,價格便宜,表達(dá)水平較高且可選擇較多表達(dá)載體等優(yōu)點,是應(yīng)用最多的系統(tǒng)[13]。迄今為止,已有很多研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行VP7蛋白表達(dá)。而本試驗利用大腸桿菌原核表達(dá)蛋白的目的是為了獲得具有免疫原性的重組蛋白并將VP7作為包被抗原初步建立間接ELISA 方法[14]。

本研究通過不同誘導(dǎo)時間,不同IPTG 濃度,不同誘導(dǎo)溫度,比較HIS標(biāo)簽標(biāo)記的VP7重組蛋白表達(dá)量的差異和可溶性表達(dá)程度的不同。經(jīng)SDSPAGE分析結(jié)果顯示重組VP7蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá),Western blot結(jié)果顯示VP7蛋白與HIS標(biāo)簽融合表達(dá)。隨后對包涵體純化蛋白,對包涵體蛋白進(jìn)行變性獲得生物學(xué)活性,釋放出蛋白質(zhì),再進(jìn)行復(fù)性,采用鎳柱對復(fù)性的蛋白進(jìn)行純化。純化后蛋白無明顯雜蛋白,SDS-PAGE 結(jié)果顯示獲得清晰的目的條帶,純化效果良好。

ELISA 是一種定量試驗,能夠檢測到樣品中的蛋白和抗體等效價含量的技術(shù)[15-16]。利用VP7蛋白建立的間接ELISA 診斷技術(shù),是對于判斷免疫后動物血清抗體效價的常用方法。本次試驗使用純化后的全病毒作為免疫原進(jìn)行免疫健康山羊,然后以大腸桿菌表達(dá)的VP7抗原作為包被抗原,利用間接ELISA 方法檢測免疫后的血清中VP7 抗體的效價[17]。常用ELISA 檢測一共分為4 種:直接ELISA、間接ELISA、競爭ELISA 和雙抗體夾心ELISA[18]。其中間接法與直接法相似,不同之處一抗只能識別結(jié)合包被抗原,二抗作為酶標(biāo)抗體辨識一抗來測定抗原量[19]。優(yōu)勢:二抗具有多種選擇,能做不一樣的測定剖析[20]。缺點:二抗和一抗的相互反應(yīng)幾率較高,所以必須設(shè)對照孔排除非特異性反應(yīng)[21]。

建立的間接ELISA 方法的特異性較好,與其他羊病毒感染的羊血清無交叉反應(yīng),敏感性為90%。利用已經(jīng)建立好的檢測方法,檢測5只免疫后羊的抗體效價,選擇最后1次加強(qiáng)免疫后效價最高的羊血清進(jìn)行抗體的純化。由全抗原免疫動物產(chǎn)生的多克隆抗體中,既包含識別目的蛋白的抗體,也包含識別其他雜蛋白的抗體。目前較常用的多克隆抗體純化方法包括辛酸飽和硫酸銨法[22]、蛋白A 親和純化法和抗原親和純化法[23]。本次使用親和層析法純化高免血清,純化后的抗體具有清晰的輕鏈和重鏈,能夠識別抗原且濃縮后抗體質(zhì)量濃度達(dá)1.98 g/L。