張軍建 張礦召

研究表明，HCV NS3蛋白與HCV相關(guān)的肝細胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系[1],但其確切機制尚不明確。端粒酶(telomerase)的激活是細胞惡變和異常增殖的標志，HCV NS3蛋白可以激活肝癌細胞HepG2細胞的端粒酶活性，可能是細胞惡性轉(zhuǎn)化的原因之一[2]。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白的人正常肝細胞模型，用于研究HCV NS3基因?qū)θ苏８渭毎脑鲋城闆r以及對端粒酶的影響。

材料與方法

一、材料

(一)細胞株、質(zhì)粒和菌株 人正常肝細胞株L02購自中國科學院細胞庫，質(zhì)粒pcDNA3.1(+)與大腸埃希菌菌株DH5a感受態(tài)細胞購自Thermo Fisher Scientific 公司，用于目的基因的插入和擴增。

(二)酶與試劑 胎牛血清、胰酶、G418、1640培養(yǎng)基和脂質(zhì)體Lipofectamine2000系美國Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ購自MBI 公司；T4 DNA 連接酶購自大連寶生物公司；Qiagen Plasmid Midi 試劑盒質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen 公司；PCR 試劑盒、RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒、DNA 分子質(zhì)量標記均為Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；MTT為Amresco公司產(chǎn)品； HCV NS3 單克隆抗體(MA1-21376)購自美國Invitrogen公司；端粒酶檢測試劑盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA)購自德國Roche公司。

二、方法

(一)質(zhì)粒構(gòu)建 以HCV基因亞型2a的JFH1病毒株為HCV NS3擴增模板，利用軟件設(shè)計PCR 引物，引物兩端分別加上Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的片段進行序列測定確認PCR 擴增無誤。分別對鑒定后的HCV NS3平端基因片段和pcDNA3.1(+)用內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ進行雙酶切，并用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取克隆進行測序鑒定。鑒定后的陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，并將pcDNA3.1(+)/HCV NS3質(zhì)粒用試劑盒提取和純化。

(二)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng) 細胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000說明書操作。細胞培養(yǎng)條件為：10%滅火胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37 ℃，體積分數(shù)為0.05的CO2。將pcDNA3.1(+)/HCV NS3質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染L02細胞，另外設(shè)定沒有轉(zhuǎn)染的L02細胞為對照組。轉(zhuǎn)染后的細胞用含有400 mg/L G418的培養(yǎng)基進行加壓篩選，當對照組細胞完全死亡后，改用150 mg/L G418的選擇培養(yǎng)基維持篩選，將篩選后的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株挑選單個克隆，用RT-PCR的方法鑒定后進行擴大培養(yǎng)。

(三)蛋白質(zhì)印跡檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中HCV NS3蛋白表達 收集對數(shù)生長期細胞，PBS洗3次后，用RIPA裂解細胞，離心后取上清進行蛋白質(zhì)印跡實驗。首先進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉2 h，PBST洗膜3次，用一抗HCV NS3 單克隆抗體HCV NS3(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次,用相對應(yīng)二抗室溫孵育1 h(1∶5 000稀釋), PBST洗膜3次后用ECL增強化學發(fā)光試劑盒檢測。

(四)MTT法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)后對細胞的增殖影響 取對數(shù)生長期的L02細胞，pcDNA3.1(+)細胞，pcDNA3.1(+)/HCV NS3細胞接種至96孔板，每孔5000個細胞,每種細胞32個孔，一共4塊96孔板，分別在24、48、72、96 h檢測細胞增殖情況。方法為吸棄細胞培養(yǎng)上清液，用PBS洗兩遍后，加5 g/L的MTT 20 μL到每個孔，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在每孔中加入150 μL DMSO，輕輕振蕩10 min后用酶標儀測定各孔的A值(波長490 nm)。

(五)細胞hTERT mRNA檢測 人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase , hTERT)活性的檢測嚴格按照端粒酶檢測試劑盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA)說明書進行。收集3組細胞，并用冷的PBS洗滌3遍，細胞裂解后抽提細胞總RNA，然后PCR進行擴增，擴增后的產(chǎn)物按照試劑盒進行雜交和ELISA實驗，結(jié)果用酶標儀進行測定(波長450 nm)。

結(jié) 果

一、分組

本實驗研究中一共有3組細胞，即空白細胞組(L02細胞)，陰性對照組[轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的LO2細胞，標記為pcDNA3.1(+)細胞]和實驗組[轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)/HCV NS3質(zhì)粒，可以穩(wěn)定表達目的蛋白HCV NS3的L02細胞株，標記為pcDNA3.1(+)/HCV NS3細胞]。

二、細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后HCV NS3蛋白表達的檢測

細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，用蛋白質(zhì)印跡檢測3組細胞的HCV NS3蛋白的表達，結(jié)果顯示，可以在pcDNA3.1(+)/HCV NS3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株檢測到HCV NS3蛋白(72KD)的表達，而pcDNA3.1(+)細胞和L02細胞沒有。說明穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株pcDNA3.1(+)/HCV NS3建立成功。見圖1。

注：1.L02細胞；2.pcDNA3.1(+)細胞；3.pcDNA3.1(+)/HCV細胞

圖1蛋白質(zhì)印跡檢測3組細胞HCV NS3蛋白的表達

三、MTT法檢測HCV NS3對L02細胞的增殖的影響

24、48、72、96 h 4個時間點L02細胞和pcDNA3.1(+)細胞的增殖情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)，而pcDNA3.1(+)/HCV NS3細胞在48、72、96 h表現(xiàn)出了明顯的增殖優(yōu)勢，與LO2細胞和pcDNA3.1(+)細胞相比，48、72和96 h差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

表1 MTT實驗檢測3組細胞的增殖

四、HCV NS3對L02細胞中hTERT mRNA的表達的影響

3組細胞進行RT-PCR擴增后進行以雜交為基礎(chǔ)的ELISA檢測。結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)/HCV細胞的A450為(1.933±0.027)明顯高于pcDNA3.1(+)的(0.809±0.017)和L02細胞的(0.735±0.033)，說明pcDNA3.1(+)/HCV細胞中的hTERT mRNA的表達與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

討 論

目前，沒有疫苗可以預(yù)防HCV感染，這就使得針對HCV的研究尤為重要[5-11]。

HCV NS3蛋白已被證實與肝細胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系。Kasprzak 等[12]發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達的HCV NS3 蛋白可通過抑制P21的轉(zhuǎn)錄促進細胞的增殖。Zhu等[13]證實HCV可以激活端粒酶活性，從而增加宿主細胞癌變行為的可能性?；诖?，本研究以人永生化的正常肝細胞L02作為研究對象，構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/HCV NS3重組質(zhì)粒，并建立了可以穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白的L02細胞株，以更準確的模擬病毒的慢性感染過程。經(jīng)蛋白質(zhì)印跡檢測， 有HCV NS3蛋白的表達，提示細胞株造模成功。在細胞的培養(yǎng)過程中,觀察到pcDNA3.1(+)/HCV NS3細胞具有明顯的細胞大小不同，偶可觀察到多核巨細胞，生長速度快，傳代時間變短等特點。經(jīng)MTT法檢測，重組了HCV NS3基因的L02細胞生長速度明顯增快，說明HCV NS3蛋白可以促進肝細胞的增殖。

hTERT是人端粒酶復(fù)合物的催化亞單位[14-15]。本研究中使用的L02細胞是永生化的人正常肝細胞，故未轉(zhuǎn)染的細胞也可以檢測到hTERT mRNA的表達，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HCV NS3基因的L02細胞株檢測到的hTERT mRNA的表達量要明顯高于未轉(zhuǎn)染的細胞。這些結(jié)果提示HCV NS3蛋白可以上調(diào)L02細胞hTERT mRNA的表達。前期研究表明，端粒延伸不再縮短會導(dǎo)致腫瘤細胞的無限增值，因此， hTERT基因的上調(diào)和引起的端粒酶激活可能是HCV NS3蛋白促進正常肝細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化的重要機制。