婁銀瑩，周夢潔，張穎欣，鄭文瀟，于詠蘭

鉤端螺旋體病(leptospirosis, 簡稱鉤體病)是可感染人、犬及其他多種動物呈全球性分布的人獸共患病。其病原為致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)。自1886年被報道以來，鉤體就一直活躍于除南極洲以外的區(qū)域[1]。目前我國已發(fā)現(xiàn)并分離了75種血清型，18種血清群鉤體，主要屬于問號鉤端螺旋體屬(Leptospirainterrogans)和博氏鉤端螺旋體屬(L.borgpetersenii)[2]。由于地理條件、流行血清型的多樣性，以及宿主動物地域性分布，中國不同地區(qū)人鉤體病流行具有明顯的特征[3]。

人或動物可通過接觸污染的水源、土壤而感染。有的感染者無癥狀，其他或因急性腎功能衰竭、肝損傷或肺出血綜合征等癥狀而危及生命[4]。犬作為鉤體的重要儲存宿主，可從尿液中排泄病原。當人與犬親密接觸時，增加了人暴露鉤體病的風險。北京地區(qū)養(yǎng)犬數(shù)量巨大，但卻缺乏犬鉤端螺旋體流行情況的相關數(shù)據(jù)調查。因此掌握北京地區(qū)的犬鉤體病流行特征對預防人鉤體病具有公共衛(wèi)生學意義。

1 材料與方法

1.1試劑 鉤端螺旋體快速實時熒光聚合酶鏈式反應檢測試劑盒購自北京世紀元亨有限公司。

1.2樣品來源 2017年1月至2019年2月于中農(nóng)大動物醫(yī)院、流浪動物基地、犬舍隨機采集北京各區(qū)犬血液、尿液樣本各800份，樣本均來源于不同的動物。其中醫(yī)院樣本916份，流浪動物樣本392，犬舍樣本292份。采集0.5 mL全血樣品放入EDTA抗凝管中，保存于4 ℃冰箱；采集5 mL尿液樣品裝入潔凈離心管，保存于-20 ℃于冰箱備用。

1.3 檢測方法

1.3.1DNA提取 本實驗采用鉤端螺旋體快速實時熒光PCR試劑盒進行DNA提取，具體步驟如下：若為尿液樣本，將尿液樣本置于2 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min，棄去上清，留沉渣200 μL于離心管中；直接吸取全血樣本200 μL于離心管中備用；吸取RD消化液于離心管中，再加入20 μL RD蛋白酶K，混勻，56 ℃水浴3次，每次3 min；取出冷卻后，加入300 μL的RD結合液，顛倒混勻，將離心管液體吸入吸附柱中，10 000 r/min離心1 min；棄去收集管中液體，吸取500 μL的RD洗滌液，10 000 r/min離心1 min；重復上述步驟1次；棄去收集管中液體，吸附柱放回空收集管中，13 000 r/min離心2 min，除去洗滌液；將吸附柱移入新的離心管中，于吸附柱中央加入30 μL洗脫液，室溫放置2 min，10 000 r/min離心1 min，并重復步驟1次；DNA于-20 ℃保存。

1.3.2樣本檢測 采用北京世紀元亨公司快速實時熒光PCR儀進行鉤端螺旋體的檢測，其具體操作如下：取反應管放置室溫融化，吸取模板2 μL加入反應管中，專用離心機離心1 min后，放入儀器中開始程序LEP(鉤端螺旋體)的擴增檢測。結果判定：若Ct值≤36并出現(xiàn)特征性擴增曲線，即為陽性；Ct值>36時，并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣DNA進行擴增，如仍出現(xiàn)特定的擴增曲線，則可判定為陽性；其它情況均判定為陰性。

1.3.3PCR鑒定 對qPCR檢測為陽性的樣本，采用文獻[5]報道的致病性鉤體特異性擴增引物G1/G2和文獻[6]報道的secY基因引物進行鉤體菌屬的PCR鑒定。

1.3.4血清學檢測 將qPCR陽性病犬的血清樣本送吉林大學動物醫(yī)學院人獸共患病重點實驗室進行顯微凝集試驗，對其進行血清群分型鑒定[7]。

1.4數(shù)據(jù)分析 采用χ2檢驗對流行病學風險因素如：區(qū)域分布、季節(jié)、個體差異等因素進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1犬鉤端螺旋體感染情況 試驗共采集樣本1 600份(血液、尿液各800份)。采用qPCR方法檢測犬致病性鉤端螺旋體病原，結果共檢測出17份(1.06%)陽性(見表1)。其中尿液陽性樣本16份(2.00%)，血液陽性樣本1份(0.13%)。尿液和血液樣本檢出率差別有統(tǒng)計學意義(χ2=11.653，P<0.01)，尿液樣本檢出率遠遠高于血液樣本。

表1 犬鉤端螺旋體qPCR檢測結果
Tab.1 qPCR results of canine leptospira

2.2PCR與血清學檢測結果 PCR鑒定結果顯示，12份檢測樣本在285 bp或549 bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶。擴增產(chǎn)物測序后經(jīng)GenBank序列比對鑒定為問號鉤端螺旋體。此外12份送檢血清樣本經(jīng)顯微凝集實驗檢測抗體均為陽性(其中包含5份普通PCR擴增為陰性病例血清樣本)，主要凝集血清群為澳洲群(9/12)、拜倫群(11/12)。綜上，犬鉤端螺旋體感染率為1.06%(17/1600)。

2.3 流行病學風險因素分析

2.3.1地區(qū)分布 如表2所示為犬鉤端螺旋體感染樣本的地區(qū)分布情況，樣本遍布北京各個城區(qū)，但延慶和懷柔等地由于位置太偏，采集樣本較少。各地區(qū)犬鉤端螺旋體感染差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=17.828，P<0.05)。

表2 犬鉤端螺旋體感染與地區(qū)分布
Tab.2 Regional distribution of canine leptospira infection

風險因素感染/感染率(n=17)(%)未感染(n=1 583)χ2P地區(qū)17.8280.048① 東城0(0)81 西城0(0)100 石景山0(0)87 大興0(0)120 昌平0(0)140 延慶0(0)6 順義1(0.71)140 海淀5(2.75)178 豐臺5(4.03)119 門頭溝1(1.35)73 懷柔0(0)47 平谷0(0)74 密云0(0)55 朝陽4(2.84)137 通州1(1.19)83 房山0(0)82

注：①表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3.2季節(jié)分布 樣本季節(jié)分布與感染情況如表3所示。不同季節(jié)鉤體感染陽性率差異性較大，秋季鉤體感染率(2.39%)顯著高于其他3個季節(jié)，季節(jié)性差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.916，P<0.05)。

表3 犬鉤端螺旋體感染與季節(jié)分布
Tab.3 Seasonal distribution of canine leptospira infection

風險因素感染/感染率(n=17)(%)未感染(n=1 583)χ2P季節(jié)10.9160.022①春季(3-5月)2(0.59)339夏季(6-8月)2(0.41)489秋季(9-11月)11(2.39)450冬季(12-2月)2(0.65)305

注：①表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3.3個體因素 樣本個體因素(年齡、性別、品種以及來源)分布見表4。在年齡方面，以1～6y年齡段發(fā)病率最高，但與其他2個分組年齡段差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.103，P>0.05)。同樣在性別方面，雄性犬較雌性犬高發(fā)，然而統(tǒng)計學顯示性別間感染率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.424，P>0.05)。

在來源方面，由于家養(yǎng)犬尿液樣本收集較流浪犬和犬舍犬更容易，所以陽性檢出率較高?；既畞碓床町悷o統(tǒng)計學意義(χ2=9.432，P<0.01)。由于犬品種繁多，不利于統(tǒng)計分析，特簡化品種分類，將其分為雜種犬和純種犬。不同品種間感染率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.427，P>0.05)。

表4 犬鉤端螺旋體感染與個體因素
Tab.4 Individual factors of canine leptospira infection

風險因素感染/感染率(n=17)(%)未感染(n=1 583)χ2P年齡1.1030.613 <1 y2(0.99)200 1～6 y11(1.32)825 >6 y4(0.71)558性別1.4240.223 雌性3(0.55)545 雄性14(1.33)1038來源9.4320.0058① 家養(yǎng)16(1.75)900 流浪1(0.26)391 犬舍0(0)292品種0.4270.448 雜種犬14(0.74)539 純種犬13(1.23)1044

注：①表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4陽性病例信息 17例病犬均表現(xiàn)為厭食、嘔吐、腹痛、多飲多尿以及黃疸等一種或多種癥狀，且均未進行鉤體疫苗免疫。病史信息統(tǒng)計顯示患犬均曾接觸死水或在野外游泳。電話回訪發(fā)現(xiàn)，7例患犬表現(xiàn)出嚴重的肝腎損傷而死亡或被安樂死；其寵物主人目前尚未有感染鉤體的癥狀。

3 討 論

鉤端螺旋體病是重要的自然疫源性疾病。我國受鉤體病危害較大，雖然近年來(2001-2013年)鉤體病流行率逐漸降低，但是病死率依然維持在1.10%～3.90%[8]。北京地區(qū)早在上世紀90年代就有關于人鉤體病的報道[9]。犬作為我國華北地區(qū)鉤體感染的主要宿主之一[2]，特別是在養(yǎng)犬數(shù)量最大的北京，對于人鉤體病感染具有潛在威脅。

3.1感染情況 世界各地均有犬鉤體病的報道：美國犬鉤體病血清學陽性率為12%[10]，歐洲各地區(qū)PCR陽性率1.50%～8.00%不等[11]。我國關于犬鉤體病的流行病學卻報道不多。2010年齊海霞等[12]運用PCR方法獲得北京地區(qū)犬鉤體病陽性率為28.60%(尿液樣本)，遠遠高于其他國家。本次試驗得出北京地區(qū)犬鉤端螺旋體分子流行率達1.06%，遠低于前人試驗結果，與試驗選擇的樣本和區(qū)域范圍有關。同時臨床抗生素廣泛使用，極大的降低了鉤體抗原的檢出率[13]，北京地區(qū)犬鉤體病陽性率可能被低估。此外，試驗發(fā)現(xiàn)尿液樣本檢出率高于血液樣本(χ2=11.653，P<0.01)。急性期鉤體病菌血癥持續(xù)時間短[14]。所以在臨床對疑似鉤體病犬，我們要同時進行尿液PCR的檢測。

3.2風險因素分析 任何年齡、品種和性別的犬都有感染鉤體病的風險[15]。本次試驗顯示這三者均不是北京地區(qū)犬鉤體病感染的風險因素。然而其他研究顯示幼年犬的鉤體感染率顯著高于老年犬[11]。雄性犬感染率雖遠高于雌性犬，但差異無統(tǒng)計學意義。這也與Koizumi等[16]人的研究結果類似。由于流浪犬和犬舍犬尿液樣本獲取困難，導致家養(yǎng)犬鉤體陽性率顯著高于其他來源的犬。雖然如此，這些家養(yǎng)犬的感染很大可能與野外游玩或接觸水源密切相關。

季節(jié)變化與地區(qū)分布是犬鉤體病感染的風險因素。鉤體病是季節(jié)性疾病，我國人鉤體病以夏季(7、8月)、初秋(9月)為流行高峰[3]。試驗結果顯示秋季鉤體感染率顯著高于其他季節(jié)，這也與美國[17]和瑞士[11]等國家犬鉤體病流行情況一致。北京地處溫帶地區(qū)，鉤體發(fā)病率較低。但犬鉤體病在城區(qū)分布上呈現(xiàn)出差異性，高度提示在部分區(qū)域需要重視犬鉤體病。

北京地區(qū)存在犬鉤體病的流行，但容易被大眾忽視。因此我們應當加強對寵物主人關于鉤端螺旋體病的宣傳教育，加強對寵物犬鉤體疫苗的定期預防免疫，以降低犬鉤體病帶來的環(huán)境衛(wèi)生風險。

利益沖突：無

引用本文格式：婁銀瑩，周夢潔，張穎欣，等.2017-2019北京地區(qū)犬鉤端螺旋體病流行病學調查[J].中國人獸共患病學報，2020,36(1):56-59. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.182