王 靜，安方玉，陳雪娟

(1.蘭州市第二人民醫(yī)院，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

圍絕經(jīng)期婦女因卵巢功能衰退引發(fā)性激素和促性腺激素之間的調(diào)節(jié)紊亂，從而導(dǎo)致機(jī)體抗氧化作用減弱，自由基清除功能下降。約2/3的婦女在圍絕經(jīng)期出現(xiàn)以植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主的癥狀，多表現(xiàn)為煩躁易怒、潮熱多汗、失眠多夢(mèng)、心悸、抑郁等[1-3]，嚴(yán)重影響圍絕經(jīng)期婦女的生活質(zhì)量。如何延緩卵巢衰老，提高圍絕經(jīng)期婦女的生活質(zhì)量，成為醫(yī)學(xué)界具有重要現(xiàn)實(shí)意義的研究課題。本研究通過(guò)觀察玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征模型大鼠血清雌二醇(estradiol，E2)、卵泡刺激素(follicle -stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)的含量和子宮組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影響，探討其抗氧化機(jī)制，從而為其治療圍絕經(jīng)期綜合征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物飼養(yǎng)室提供，合格證號(hào) SCXK(甘)2011-0007。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 試劑

大鼠雌二醇(estradiol，E2)ELISA檢測(cè)試劑盒、大鼠促卵泡素(Follicle- stimulating Hormone，F(xiàn)SH)ELISA檢測(cè)試劑盒、大鼠促黃體激素(Luteinizing hormone，LH)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)201708，品牌均為源葉生物；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為 20181125、201810905，品牌均為南京建成；戊酸雌二醇片購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司(規(guī)格1 mg/片，批號(hào)156 A)。

1.3 儀器

FA2004 N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；ZY12306型微量加樣器(Scien TiFic公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)；DNM-9606型酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量分析儀(深圳市三利化學(xué)品有限公司)；BX53型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.4 藥物

玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑由玫瑰6 g、紅芪15 g、當(dāng)歸10 g組成，均購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心夏鵬飛老師鑒定。具體換算方法參照參考文獻(xiàn)[4]，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑人用劑量是31 g/d，根據(jù)大鼠與人的體表面積換算法得到大鼠的中劑量31×0.018×5≈2.8 g/kg，此劑量屬于臨床等效劑量，即玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑低、中、高劑量分別為1.4、2.8、5.6 g/kg，分別相當(dāng)于臨床等效劑量 0.5、1、2倍，雌激素戊酸雌二醇片的給藥劑量為0.09 mg/kg。

2 方法

2.1 圍絕經(jīng)期綜合征大鼠模型的建立

將Wistar雌性大鼠70只隨機(jī)分為假手術(shù)組(15只)和卵巢切除組(55只)，參照文獻(xiàn)[5-6]，采用手術(shù)切除法切除卵巢切除組大鼠的雙側(cè)卵巢。每只大鼠分別以 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，俯臥位下無(wú)菌切開雙側(cè)背部并揭開脂肪層，結(jié)扎卵巢和子宮的交接處，徹底摘除兩側(cè)卵巢，逐層縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠則同樣切開腹腔，揭開脂肪層，將卵巢移出后復(fù)位，并不切除卵巢而縫合切口。造模后第7天假手術(shù)組和卵巢切除組各取5只大鼠，用ELISA法檢測(cè)兩組大鼠的血清雌二醇(estradiol，E2)含量以判定造模是否成功。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水，正常喂食，將實(shí)驗(yàn)室溫度設(shè)置為25 ℃±2℃，濕度設(shè)置為65%±5%，每天光照12 h，每周通過(guò)稱重調(diào)節(jié)給藥量，連續(xù)給藥6周。

2.2 分組與給藥

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，于術(shù)后第2周根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)將卵巢切除組的大鼠分為卵巢切除組、玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑低、中、高劑量組(1.4、2.8、5.6 g/kg)和戊酸雌二醇片組(0.09 mg/kg)，另設(shè)假手術(shù)組每組各10只。各干預(yù)組的給藥體積均為10 ml/kg，灌胃給藥，假手術(shù)組和卵巢切除組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)6周。

2.3 動(dòng)物體質(zhì)量及子宮系數(shù)測(cè)定

末次給藥后，稱量各組動(dòng)物體質(zhì)量后，腹腔麻醉后股動(dòng)脈采血處死各組動(dòng)物，開腹摘取各組動(dòng)物的雙側(cè)子宮，并將子宮周圍附著的脂肪組織剝離干凈后稱重，計(jì)算子宮系數(shù)：子宮系數(shù)(mg/g)=子宮質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.4 ELISA法檢測(cè)各組動(dòng)物血清E2、FSH和LH含量

末次給藥后，腹腔麻醉后股動(dòng)脈采血，室溫靜置 2 h，2500rpm/min離心15 min，分離血清-80 ℃ 保存，分別用ELISA檢測(cè)試劑盒，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組動(dòng)物血清E2、FSH和LH的含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5 子宮組織的病理學(xué)切片檢測(cè)

將上述每組大鼠的子宮組織切取約200 mg，留作SOD活性和MDA含量檢測(cè)，剩余的子宮組織每組取6個(gè)用4%多聚甲醛固定，將固定好的子宮組織脫水后采用石蠟包埋法制作蠟塊，并用切片機(jī)切片，切片厚度約5 μm，蘇木精-伊紅染色、封片。在10×20倍鏡下，每張子宮切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察各組動(dòng)物子宮組織的子宮管徑粗細(xì)、子宮內(nèi)膜厚度、子宮腺體數(shù)量、單層柱狀上皮細(xì)胞的排列等。

2.6 子宮組織SOD活性和MDA含量測(cè)定

將上述切取好的子宮組織用手術(shù)剪刀迅速剪碎后放入5 ml的塑料試管中，加入1.8 ml的4℃冰生理鹽水，用電動(dòng)勻漿器在冰浴環(huán)境下進(jìn)行勻漿，制備成10%的勻漿液，3000rpm/min離心15 min，吸取上清液，用比色分析法測(cè)定各組動(dòng)物子宮組織SOD的活性和MDA的含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠體質(zhì)量及子宮系數(shù)的影響

表1示，與假手術(shù)組比較，卵巢切除組大鼠的體質(zhì)量明顯升高，子宮系數(shù)明顯下降(P<0.05)；與卵巢切除組比較，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑中、高劑量組和戊酸雌二醇片組大鼠體質(zhì)量明顯降低，子宮系數(shù)明顯增加(P<0.05)。

表1 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠體重及子宮系數(shù)的影響

3.2 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠血清E2、FSH和LH含量的影響

表2示，與假手術(shù)組比較，卵巢切除組大鼠的血清E2含量明顯降低，F(xiàn)SH和LH含量明顯升高(P<0.05)；與卵巢切除組比較，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑各給藥組和戊酸雌二醇片組大鼠血清E2含量明顯增加，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑中、高劑量組和戊酸雌二醇片組FSH和LH含量明顯降低(P<0.05)。

表2 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠血清E2、FSH和LH含量的影響

3.3 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠子宮組織病理形態(tài)變化的影響

圖1示，假手術(shù)組大鼠子宮管徑較粗，內(nèi)膜深厚，腺體豐富，單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊；卵巢切除組、玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑低、中劑量組大鼠子宮壁明顯變薄，管腔狹窄，黏膜層腺體消失，固有層細(xì)胞密集，柱狀上皮細(xì)胞排列紊亂；玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑高劑量組大鼠子宮壁變薄，管腔狹窄，黏膜層出現(xiàn)腺體，單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊；戊酸雌二醇組大鼠子宮壁變薄，管腔狹窄，單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊。

圖1 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠子宮組織病理形態(tài)改變比較(HE，×200)

3.4 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠子宮組織SOD活性和MDA含量的影響

表3示，與假手術(shù)組比較，卵巢切除組大鼠子宮組織的SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；與卵巢切除組比較，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑中、高劑量組和戊酸雌二醇片組大鼠子宮組織的SOD活性均明顯增加，MDA含量明顯降低(P<0.05)。

表3 玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠子宮組織SOD活性和MDA含量影響比較

4 討論

圍絕經(jīng)期綜合征是由于女性卵巢功能逐漸衰退和自身雌激素水平分泌下降而引起機(jī)體衰老的一種臨床綜合征[8]。而機(jī)體自由基的蓄積是促成女性衰老的重要因素[8]，其發(fā)病機(jī)制的根本是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)失衡[3]。

自由基堆積引起的卵巢老化是一個(gè)較為復(fù)雜的生物過(guò)程。MDA 是氧自由基引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的一種終產(chǎn)物，SOD 是機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中唯一能直接清除自由基的酶。為此，MDA的含量變化可以間接反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化作用的程度[9]，SOD 的活性大小可作為機(jī)體抗衰老能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。研究已證實(shí)[10]，抗氧化酶(SOD、CAT)活性的下降和氧自由基含量的增多會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物卵巢黃體溶解及黃體酮生成減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，卵巢切除組大鼠子宮組織SOD活性下降，MDA含量上升，而玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑可以提高圍絕經(jīng)期綜合征大鼠子宮組織SOD活性，降低其子宮組織MDA含量，說(shuō)明玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑可以通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化功能來(lái)清除圍絕經(jīng)期綜合征大鼠自由基的蓄積，延緩衰老。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，雌激素分泌逐漸減少是婦女發(fā)生圍絕經(jīng)期綜合癥的主要原因。雌激素的分泌減少使其對(duì)下丘腦-垂體負(fù)反饋抑制作用減弱或消失，致使垂體促性腺激素分泌增加。由腺垂體分泌的FSH 一方面通過(guò)促進(jìn)卵泡細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育以利于生殖細(xì)胞的成熟，另一方面通過(guò)促進(jìn)新細(xì)胞合成 FSH 受體，增強(qiáng) FSH 對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的作用，而由腺垂體分泌的LH可使顆粒細(xì)胞黃素化并分泌黃體酮[11]。上述激素的分泌變化促使子宮、陰道、乳腺等生殖器官出現(xiàn)萎縮，而臟器系數(shù)下降是判定器官萎縮、退行性變的標(biāo)準(zhǔn)之一[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期綜合征患者發(fā)生潮熱前，LH 經(jīng)垂體脈沖樣釋放，LH 水平越高說(shuō)明患者癥狀越嚴(yán)重[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢切除組大鼠子宮系數(shù)明顯降低，血清中E2含量顯著降低，F(xiàn)SH、LH含量明顯升高。這一結(jié)果說(shuō)明機(jī)體去卵巢后，E2水平下降是引起下丘腦-垂體-卵巢軸功能衰退的根本原因。當(dāng)給予玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑后，子宮系數(shù)明顯升高；血清中E2含量顯著升高，F(xiàn)SH、LH含量明顯降低。進(jìn)一步推測(cè)其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)去卵巢模型大鼠的性激素水平，增加雌激素生物效應(yīng)，改善下丘腦-垂體-卵巢軸功能，從而延緩生殖器官退行性變化。

因此，玫瑰紅芪當(dāng)歸水煎劑可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能來(lái)減輕圍絕經(jīng)期綜合征大鼠的氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)通過(guò)增加機(jī)體的雌激素生物效應(yīng)來(lái)改善下丘腦-垂體-卵巢軸功能，從而發(fā)揮延緩生殖器官退行性變的作用，其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚需今后進(jìn)一步研究。