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        大黃素干預(yù)慢性壓迫性損傷模型髓鞘蛋白表達的研究?

        2020-03-13 09:07:02渠景連王文靜吳智兵
        關(guān)鍵詞:髓鞘黃素過敏

        陳 鵬,王 琛,張 冕,渠景連,王文靜,吳智兵,3△

        (1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴陽 550025;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510405;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣州 510405)

        神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP)在普通人群中患病率約為6.9%~10%[1],其造成的異常性疼痛、痛覺過敏及自發(fā)性疼痛嚴(yán)重影響患者的日常生活及行為功能,給社會造成巨大的經(jīng)濟和醫(yī)療負擔(dān)[2-4]。目前治療NP的抗癲癇、抗焦慮及阿片類藥物臨床效果有限,存在頭暈、嗜睡甚至引發(fā)心律失常等嚴(yán)重不良反應(yīng)[5-7]。大黃素為中藥大黃的主要有效成分,屬于天然的蒽醌類衍生物。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),中劑量(50 mg/kg)大黃素能顯著改善神經(jīng)病理性疼痛CCI模型實驗大鼠自發(fā)性疼痛,緩解機械及熱痛覺過敏表現(xiàn)[8]。事實上,外周神經(jīng)損傷后引發(fā)華勒氏變性并啟動自我破壞程序是NP形成的重要原因,同時近年來越來越多研究認為大黃素能夠通過干預(yù)多種不同的信號通路,從而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病形成過程中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[9]。故本實驗擬探究大黃素干預(yù)下CCI大鼠脊髓組織中MBP、MPZ表達情況,明確大黃素是否通過調(diào)節(jié)髓鞘再生作用達到緩解疼痛的效果。

        1 材料與方法

        1.1 試劑及儀器

        SPF級7周齡雄性大鼠30只,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供,生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0034。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物實驗室。本實驗已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物使用與倫理委員會審查。一抗MBP兔抗、MPZ兔抗以及山羊抗兔二抗均購自美國Proteintech公司,貨號分別為10458-1-AP、10572-1-AP、12472-1-AP、SA00001-2;PCR反應(yīng)所需試劑SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購自日本TAKARA公司。本實驗所用熱輻射測痛儀器、Von Frey電子測痛儀購自美國IITC-Life Science公司;伯樂ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)以及7500PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

        1.2 動物模型與分組

        將30只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、CCI組及大黃素組各10只,按照Bennett和Xie創(chuàng)立的手術(shù)方法制作CCI模型[10]。術(shù)前各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,切開其左下肢中段皮膚,逐層分離肌肉后暴露坐骨神經(jīng),用4-0絲線在坐骨神經(jīng)主干做4道結(jié)扎,間距為1~2 mm,力度以神經(jīng)微微塌陷為宜。假手術(shù)組大鼠暴露坐骨神經(jīng)后不結(jié)扎,完成操作后分層縫合肌肉及皮膚,安爾碘消毒。大黃素組于造模后第1天每日灌胃1次,連續(xù)15 d,給藥量為50 mg/kg,實驗期間各組大鼠正常進食飲水。

        1.3 行為學(xué)檢測

        參照文獻,于術(shù)前及術(shù)后第3、7、11及15天用電子測痛儀及熱輻射儀對不同組大鼠進行MWT及TWL值測定[11-13]。MWT及TWL值均重復(fù)測量5次,間隔5 min取平均值。

        1.4 樣品制備

        術(shù)后15 d行為學(xué)測試結(jié)束后,將所有大鼠麻醉后取L4-L6損傷側(cè)脊髓置于-80 ℃超低溫冰箱中待檢。

        1.5 Western blot法檢測

        按照BCA試劑盒說明書對脊髓組織中提取的蛋白濃度進行測定,配制SDS-PAGE膠后開始加樣。取30 ul樣品緩慢加入樣品孔中,用80 V進行濃縮膠電泳45 min,120 V在分離膠中電泳45 min,200 mA轉(zhuǎn)膜120 min。膜浸在脫脂奶粉中室溫封閉1 h;將膜取出直接放入一抗(1∶1000)中,4 ℃反應(yīng)過夜;TBST洗膜,10 min×3次;將膜轉(zhuǎn)入二抗(1∶40000)中,37 ℃反應(yīng)1 h;PBST洗膜,10 min×3次;用化學(xué)發(fā)光法顯影。ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)拍照。Gel Pro32軟件分析不同條帶灰度值進行統(tǒng)計分析處理。

        1.6 RT-PCR檢測

        表1示,Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,選擇RT-PCR反應(yīng)的操作方法測定特異性mRNA的表達水平。使用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)進行PCR定量反應(yīng),采用PRIMER5軟件/NCBI在線設(shè)計合成引物。各組樣本的目的基因表達水平以相應(yīng)GAPDH作為參照,最終采用2-ΔΔCT計算目的基因,相對于內(nèi)參基因GAPDH的相對表達量。

        表1 目的基因引物序列

        1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果

        造模后各組實驗大鼠一般狀況良好,可自由飲水、進食及活動,毛發(fā)整潔,術(shù)側(cè)肢體未見感染及滲液,無自噬行為。結(jié)合現(xiàn)有文獻及前期預(yù)實驗結(jié)果,于術(shù)后第3天評判模型成功與否。本課題組前期進行大量探索,模型成功率達85%以上[10]。

        2.1.1 MWT值測定 表2示,與術(shù)前基線值比較,術(shù)后第3天CCI模型組及大黃素組實驗大鼠MWT值下降幅度為27.41%及23.57%,出現(xiàn)機械痛覺過敏,與既往文獻報道基本相符[10];與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。于術(shù)后第11天開始,大黃素組MWT值較前升高,與CCI模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明大黃素能夠緩解CCI大鼠機械痛覺過敏。

        表2 MWT值測定結(jié)果

        2.1.2 TWL值測定 表3示,與術(shù)前基線值比較,術(shù)后第3天模型組及大黃素組大鼠TWL值下降幅度為48.68%及41.03%,出現(xiàn)較為嚴(yán)重的熱痛覺過敏;與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。于術(shù)后第11天開始,大黃素組TWL值較前升高,與CCI模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明大黃素能緩解CCI大鼠熱痛覺過敏。

        表3 TWL值測定結(jié)果

        2.2 RT-PCR技術(shù)檢測脊髓組織中MBP、MPZ mRNA

        圖1示,與假手術(shù)組比較,模型組中MBP及MPZ表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,大黃素組實驗大鼠脊髓組織中MBP及MPZ表達均升高(P<0.05)。

        2.3 Western blot法脊髓組織MBP及MPZ蛋白表達

        圖2示,與假手術(shù)組比較,模型組中MBP及MPZ蛋白表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,大黃素組實驗大鼠脊髓組織中MBP及MPZ表達均升高(P<0.05)。

        注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01圖1 脊髓組織MBP及MPZ mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

        注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01圖2 脊髓組織MBP及MPZ 蛋白表達水平比較

        3 討論

        神經(jīng)損傷是NP形成的重要原因。早期研究已證實,損傷后相關(guān)神經(jīng)出現(xiàn)華勒氏變性并啟動自我破壞程序,這一機制是神經(jīng)病理性疼痛形成的重要組成部分[14]。而目前研究表明,神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞凋亡形成脫髓鞘改變,髓鞘蛋白崩解使軸索失去保護作用,進而通過干預(yù)興奮性電位的形成產(chǎn)生痛感。這種信號傳導(dǎo)障礙與中醫(yī)理論中疼痛形成 “不通則痛”病因病機有一定的相似之處,與之相對應(yīng)的是中藥“活血祛瘀”治則。

        大黃素是具有活血化瘀、通暢氣機作用的中藥大黃的主要成分之一。一些研究者發(fā)現(xiàn),大黃素通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡及膠質(zhì)細胞活性發(fā)揮抗炎作用。如在糖氧剝奪時大黃素可通過激活素A/Smads信號途徑的活化下調(diào)Caspase-3表達來抑制神經(jīng)元凋亡;而在脂多糖誘導(dǎo)的膠質(zhì)細胞中,可激活A(yù)MPK/Nrf2通路,降低IL-6、TNF-α等炎癥因子表達[15-16]。我們前期研究已發(fā)現(xiàn),大黃素能夠顯著改善神經(jīng)病理性疼痛CCI大鼠自發(fā)性疼痛及痛覺過敏表現(xiàn),且50 mg/kg為優(yōu)效劑量[8]。而本研究則進一步發(fā)現(xiàn),大黃素能夠顯著上調(diào)CCI模型實驗大鼠脊髓組織MBP及MPZ表達,促進髓鞘修復(fù)與再生,從而緩解疼痛。

        髓鞘主要由神經(jīng)膠質(zhì)細胞構(gòu)成,是包裹在神經(jīng)軸索外的一層膜結(jié)構(gòu)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘由少突膠質(zhì)細胞構(gòu)成,周圍神經(jīng)系統(tǒng)則由施旺氏細胞構(gòu)成,起到絕緣作用并有保護軸突作用,還能夠提高神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)速度。神經(jīng)損傷后,由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、氧化應(yīng)激反應(yīng)、谷氨酸興奮毒性及炎癥反應(yīng)等多條不同信號途徑激活后,會引起神經(jīng)纖維退化并產(chǎn)生脫髓鞘改變,甚至神經(jīng)元的凋亡[17-18]。

        中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最多的髓鞘蛋白MBP可由少突膠質(zhì)細胞合成,能夠維持髓鞘結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和緊密性。實驗研究已證實,在多種不同的NP模型脊髓組織中,MBP表達呈下調(diào)趨勢[19-20]。本實驗結(jié)果顯示,模型組中MBP蛋白及其mRNA表達水平均較假手術(shù)組出現(xiàn)顯著降低,而大黃素治療組則出現(xiàn)升高,這一趨勢的形成可能與神經(jīng)損傷引起少突膠質(zhì)細胞凋亡有關(guān),而大黃素則可能通過抑制細胞凋亡提高MBP表達。MPZ也常被稱為P0蛋白,主要由施旺氏細胞合成,因此被認為是施旺氏細胞的特殊標(biāo)記蛋白,通過其本身的細胞黏附分子屬性在維持髓鞘多層結(jié)構(gòu)及緊密性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。P0蛋白在脫髓鞘作用激活后大量表達,并且當(dāng)神經(jīng)軸索出現(xiàn)華勒氏變性時出現(xiàn)降低,而在髓鞘再生的時候表達升高。盡管關(guān)于P0蛋白的中樞機制研究有限,但有多項研究結(jié)果證明,神經(jīng)損傷后除外周神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)中P0蛋白表達量出現(xiàn)下降外,NP大鼠脊髓中MPZ蛋白及其mRNA表達量也較對照組出現(xiàn)下降[22-24]。本次實驗結(jié)果中,CCI模型后脊髓組織中MPZ較假手術(shù)組顯著降低,而大黃素能夠提高MPZ的表達水平,促進髓鞘再生,緩解神經(jīng)病理性疼痛。

        綜上所述,本實驗使用雄性SD大鼠建立NP中經(jīng)典的CCI模型。前期研究結(jié)果及行為學(xué)測試提示,大黃素具有改善CCI大鼠痛覺過敏的作用,而結(jié)合本文的研究結(jié)果考慮其作用機制可能與升高髓鞘相關(guān)蛋白MBP和P0蛋白有關(guān),并產(chǎn)生神經(jīng)保護作用,從而改善大鼠對疼痛刺激過敏的反應(yīng)??梢?,大黃素可以作為具有研究潛力的防治NP藥物。

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