陳 鵬，王 琛，張 冕，渠景連，王文靜，吳智兵,3△

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP)在普通人群中患病率約為6.9%～10%[1]，其造成的異常性疼痛、痛覺過敏及自發(fā)性疼痛嚴(yán)重影響患者的日常生活及行為功能，給社會造成巨大的經(jīng)濟和醫(yī)療負擔(dān)[2-4]。目前治療NP的抗癲癇、抗焦慮及阿片類藥物臨床效果有限，存在頭暈、嗜睡甚至引發(fā)心律失常等嚴(yán)重不良反應(yīng)[5-7]。大黃素為中藥大黃的主要有效成分，屬于天然的蒽醌類衍生物。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，中劑量(50 mg/kg)大黃素能顯著改善神經(jīng)病理性疼痛CCI模型實驗大鼠自發(fā)性疼痛，緩解機械及熱痛覺過敏表現(xiàn)[8]。事實上，外周神經(jīng)損傷后引發(fā)華勒氏變性并啟動自我破壞程序是NP形成的重要原因，同時近年來越來越多研究認為大黃素能夠通過干預(yù)多種不同的信號通路，從而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病形成過程中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[9]。故本實驗擬探究大黃素干預(yù)下CCI大鼠脊髓組織中MBP、MPZ表達情況，明確大黃素是否通過調(diào)節(jié)髓鞘再生作用達到緩解疼痛的效果。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

SPF級7周齡雄性大鼠30只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0034。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物實驗室。本實驗已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物使用與倫理委員會審查。一抗MBP兔抗、MPZ兔抗以及山羊抗兔二抗均購自美國Proteintech公司，貨號分別為10458-1-AP、10572-1-AP、12472-1-AP、SA00001-2；PCR反應(yīng)所需試劑SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購自日本TAKARA公司。本實驗所用熱輻射測痛儀器、Von Frey電子測痛儀購自美國IITC-Life Science公司；伯樂ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)以及7500PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 動物模型與分組

將30只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、CCI組及大黃素組各10只，按照Bennett和Xie創(chuàng)立的手術(shù)方法制作CCI模型[10]。術(shù)前各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，切開其左下肢中段皮膚，逐層分離肌肉后暴露坐骨神經(jīng)，用4-0絲線在坐骨神經(jīng)主干做4道結(jié)扎，間距為1～2 mm，力度以神經(jīng)微微塌陷為宜。假手術(shù)組大鼠暴露坐骨神經(jīng)后不結(jié)扎，完成操作后分層縫合肌肉及皮膚，安爾碘消毒。大黃素組于造模后第1天每日灌胃1次，連續(xù)15 d，給藥量為50 mg/kg，實驗期間各組大鼠正常進食飲水。

1.3 行為學(xué)檢測

參照文獻，于術(shù)前及術(shù)后第3、7、11及15天用電子測痛儀及熱輻射儀對不同組大鼠進行MWT及TWL值測定[11-13]。MWT及TWL值均重復(fù)測量5次，間隔5 min取平均值。

1.4 樣品制備

術(shù)后15 d行為學(xué)測試結(jié)束后，將所有大鼠麻醉后取L4-L6損傷側(cè)脊髓置于-80 ℃超低溫冰箱中待檢。

1.5 Western blot法檢測

按照BCA試劑盒說明書對脊髓組織中提取的蛋白濃度進行測定，配制SDS-PAGE膠后開始加樣。取30 ul樣品緩慢加入樣品孔中，用80 V進行濃縮膠電泳45 min，120 V在分離膠中電泳45 min，200 mA轉(zhuǎn)膜120 min。膜浸在脫脂奶粉中室溫封閉1 h；將膜取出直接放入一抗(1∶1000)中，4 ℃反應(yīng)過夜；TBST洗膜，10 min×3次；將膜轉(zhuǎn)入二抗(1∶40000)中，37 ℃反應(yīng)1 h；PBST洗膜，10 min×3次；用化學(xué)發(fā)光法顯影。ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)拍照。Gel Pro32軟件分析不同條帶灰度值進行統(tǒng)計分析處理。

1.6 RT-PCR檢測

表1示，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，選擇RT-PCR反應(yīng)的操作方法測定特異性mRNA的表達水平。使用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)進行PCR定量反應(yīng)，采用PRIMER5軟件/NCBI在線設(shè)計合成引物。各組樣本的目的基因表達水平以相應(yīng)GAPDH作為參照，最終采用2-ΔΔCT計算目的基因，相對于內(nèi)參基因GAPDH的相對表達量。

表1 目的基因引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果

造模后各組實驗大鼠一般狀況良好，可自由飲水、進食及活動，毛發(fā)整潔，術(shù)側(cè)肢體未見感染及滲液，無自噬行為。結(jié)合現(xiàn)有文獻及前期預(yù)實驗結(jié)果，于術(shù)后第3天評判模型成功與否。本課題組前期進行大量探索，模型成功率達85%以上[10]。

2.1.1 MWT值測定 表2示，與術(shù)前基線值比較，術(shù)后第3天CCI模型組及大黃素組實驗大鼠MWT值下降幅度為27.41%及23.57%，出現(xiàn)機械痛覺過敏，與既往文獻報道基本相符[10]；與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。于術(shù)后第11天開始，大黃素組MWT值較前升高，與CCI模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明大黃素能夠緩解CCI大鼠機械痛覺過敏。

表2 MWT值測定結(jié)果

2.1.2 TWL值測定 表3示，與術(shù)前基線值比較，術(shù)后第3天模型組及大黃素組大鼠TWL值下降幅度為48.68%及41.03%，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的熱痛覺過敏；與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。于術(shù)后第11天開始，大黃素組TWL值較前升高，與CCI模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明大黃素能緩解CCI大鼠熱痛覺過敏。

表3 TWL值測定結(jié)果

2.2 RT-PCR技術(shù)檢測脊髓組織中MBP、MPZ mRNA

圖1示，與假手術(shù)組比較，模型組中MBP及MPZ表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，大黃素組實驗大鼠脊髓組織中MBP及MPZ表達均升高(P<0.05)。

2.3 Western blot法脊髓組織MBP及MPZ蛋白表達

圖2示，與假手術(shù)組比較，模型組中MBP及MPZ蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，大黃素組實驗大鼠脊髓組織中MBP及MPZ表達均升高(P<0.05)。

注:與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01圖1 脊髓組織MBP及MPZ mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05，##P<0.01圖2 脊髓組織MBP及MPZ 蛋白表達水平比較

3 討論

神經(jīng)損傷是NP形成的重要原因。早期研究已證實，損傷后相關(guān)神經(jīng)出現(xiàn)華勒氏變性并啟動自我破壞程序，這一機制是神經(jīng)病理性疼痛形成的重要組成部分[14]。而目前研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞凋亡形成脫髓鞘改變，髓鞘蛋白崩解使軸索失去保護作用，進而通過干預(yù)興奮性電位的形成產(chǎn)生痛感。這種信號傳導(dǎo)障礙與中醫(yī)理論中疼痛形成 “不通則痛”病因病機有一定的相似之處，與之相對應(yīng)的是中藥“活血祛瘀”治則。

大黃素是具有活血化瘀、通暢氣機作用的中藥大黃的主要成分之一。一些研究者發(fā)現(xiàn)，大黃素通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡及膠質(zhì)細胞活性發(fā)揮抗炎作用。如在糖氧剝奪時大黃素可通過激活素A/Smads信號途徑的活化下調(diào)Caspase-3表達來抑制神經(jīng)元凋亡；而在脂多糖誘導(dǎo)的膠質(zhì)細胞中，可激活A(yù)MPK/Nrf2通路，降低IL-6、TNF-α等炎癥因子表達[15-16]。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠顯著改善神經(jīng)病理性疼痛CCI大鼠自發(fā)性疼痛及痛覺過敏表現(xiàn)，且50 mg/kg為優(yōu)效劑量[8]。而本研究則進一步發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠顯著上調(diào)CCI模型實驗大鼠脊髓組織MBP及MPZ表達，促進髓鞘修復(fù)與再生，從而緩解疼痛。

髓鞘主要由神經(jīng)膠質(zhì)細胞構(gòu)成，是包裹在神經(jīng)軸索外的一層膜結(jié)構(gòu)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘由少突膠質(zhì)細胞構(gòu)成，周圍神經(jīng)系統(tǒng)則由施旺氏細胞構(gòu)成，起到絕緣作用并有保護軸突作用，還能夠提高神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)速度。神經(jīng)損傷后，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、氧化應(yīng)激反應(yīng)、谷氨酸興奮毒性及炎癥反應(yīng)等多條不同信號途徑激活后，會引起神經(jīng)纖維退化并產(chǎn)生脫髓鞘改變，甚至神經(jīng)元的凋亡[17-18]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最多的髓鞘蛋白MBP可由少突膠質(zhì)細胞合成，能夠維持髓鞘結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和緊密性。實驗研究已證實，在多種不同的NP模型脊髓組織中，MBP表達呈下調(diào)趨勢[19-20]。本實驗結(jié)果顯示，模型組中MBP蛋白及其mRNA表達水平均較假手術(shù)組出現(xiàn)顯著降低，而大黃素治療組則出現(xiàn)升高，這一趨勢的形成可能與神經(jīng)損傷引起少突膠質(zhì)細胞凋亡有關(guān)，而大黃素則可能通過抑制細胞凋亡提高MBP表達。MPZ也常被稱為P0蛋白，主要由施旺氏細胞合成，因此被認為是施旺氏細胞的特殊標(biāo)記蛋白，通過其本身的細胞黏附分子屬性在維持髓鞘多層結(jié)構(gòu)及緊密性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。P0蛋白在脫髓鞘作用激活后大量表達，并且當(dāng)神經(jīng)軸索出現(xiàn)華勒氏變性時出現(xiàn)降低，而在髓鞘再生的時候表達升高。盡管關(guān)于P0蛋白的中樞機制研究有限，但有多項研究結(jié)果證明，神經(jīng)損傷后除外周神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)中P0蛋白表達量出現(xiàn)下降外，NP大鼠脊髓中MPZ蛋白及其mRNA表達量也較對照組出現(xiàn)下降[22-24]。本次實驗結(jié)果中，CCI模型后脊髓組織中MPZ較假手術(shù)組顯著降低，而大黃素能夠提高MPZ的表達水平，促進髓鞘再生，緩解神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所述，本實驗使用雄性SD大鼠建立NP中經(jīng)典的CCI模型。前期研究結(jié)果及行為學(xué)測試提示，大黃素具有改善CCI大鼠痛覺過敏的作用，而結(jié)合本文的研究結(jié)果考慮其作用機制可能與升高髓鞘相關(guān)蛋白MBP和P0蛋白有關(guān)，并產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，從而改善大鼠對疼痛刺激過敏的反應(yīng)?？梢?，大黃素可以作為具有研究潛力的防治NP藥物。