彭穎，龔光輝，李景和, ，王俊普,

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大誘因[1]。HCC的機(jī)理與基因突變的增量積累相關(guān)，從而產(chǎn)生異常的免疫應(yīng)答、細(xì)胞周期、和血管生成[2]。至于免疫應(yīng)答，效應(yīng)免疫細(xì)胞可以對(duì)HCC進(jìn)行免疫控制，從而有效減少惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然而，HCC進(jìn)展過(guò)程清楚地顯示腫瘤免疫控制的失敗會(huì)抑制抗癌免疫反應(yīng)[3]。

隨著醫(yī)療技術(shù)的迅速發(fā)展，HCC的診斷和治療已大大改善，但預(yù)后仍然很差，5年生存率低于40%。盡管有多種預(yù)后生物標(biāo)志物，包括甲胎蛋白（AFP）、DES-γ羧基凝血酶、和細(xì)胞角蛋白19被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中[4]，但它們的有效性會(huì)被各種因素影響，而且單個(gè)指標(biāo)的預(yù)測(cè)能力不足。相反，基因標(biāo)簽提供更好的預(yù)測(cè)性能，多基因預(yù)后標(biāo)簽可以指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇適當(dāng)?shù)闹委焄5]。

最近，能夠促進(jìn)免疫系統(tǒng)攻擊癌細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的開(kāi)發(fā)取得了顯著成功[6]，在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)知網(wǎng)中檢索肝細(xì)胞癌、免疫基因、預(yù)后模型等關(guān)鍵詞，尚未有研究構(gòu)建HCC的免疫相關(guān)基因標(biāo)簽預(yù)后模型。

因此本研究基于The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)于HCC鑒定有效且可靠的免疫基因相關(guān)生物標(biāo)志物以進(jìn)行預(yù)后預(yù)測(cè)。利用R語(yǔ)言在HCC中挖掘差異表達(dá)的免疫基因，結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC臨床樣本并分析患者的預(yù)后，選擇其中與預(yù)后明顯相關(guān)的免疫基因構(gòu)建可以預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的基因標(biāo)簽。鑒定模型中的核心免疫基因和途徑可以增強(qiáng)臨床應(yīng)用，提供新的治療靶點(diǎn)并產(chǎn)生有關(guān)癌癥進(jìn)展的新見(jiàn)解。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及研究?jī)?nèi)容

完整的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息可從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cancergenome.nih.gov）獲得。本次研究包括377個(gè)HCC樣本和50個(gè)相鄰的非癌性組織樣本。提取相應(yīng)的臨床信息，包括年齡、性別、TNM分類、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤狀態(tài)等。從Immport數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.immport.org/home）下載免疫基因相關(guān)信息。使用R語(yǔ)言的limma包提取差異表達(dá)的免疫相關(guān)差異基因。除去臨床信息不完整，隨訪信息＜30 d的患者，用單變量Cox回歸分析評(píng)估與344例HCC患者總體生存率（OS）顯著相關(guān)的免疫基因，然后使用多元Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析進(jìn)行進(jìn)一步篩選，計(jì)算每個(gè)基因的危險(xiǎn)比（HR）。然后，根據(jù)表達(dá)水平的線性組合構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分由從多元Cox回歸分析獲得的回歸系數(shù)加權(quán)，使用中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將344例患者分為高風(fēng)險(xiǎn)分組和低風(fēng)險(xiǎn)分組。同時(shí)從上述344例模型樣本中隨機(jī)抽取50%的病例（172例）為驗(yàn)證樣本行內(nèi)部驗(yàn)證。使用Kaplan-Meier曲線比較兩組的預(yù)后，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)評(píng)估差異。繪制ROC曲線以分析預(yù)測(cè)患者總體生存的有效性。用Z檢驗(yàn)檢查ROC曲線的曲線下面積（AUC）和一致性指數(shù)（C-index）分析模型的準(zhǔn)確性。進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析以研究特征性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R 3.6.1（www.r-project.org）進(jìn)行，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC中差異表達(dá)的免疫基因鑒定

使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析了377個(gè)HCC和50個(gè)正常肝臟樣品中2 498個(gè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，并鑒定了329個(gè)差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因，包括267個(gè)上調(diào)的免疫相關(guān)基因和62個(gè)下調(diào)的免疫相關(guān)基因（FDR＜0.05，|log2FC|＞1）（圖1）。

2.2 與HCC生存相關(guān)的免疫相關(guān)基因鑒定

對(duì)HCC中329個(gè)差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了單變量Cox回歸分析，以鑒定預(yù)后性差異免疫相關(guān)基因。數(shù)據(jù)顯示，24個(gè)差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因的表達(dá)與HCC患者的OS明顯有關(guān)（均P＜0.001）。為了確定預(yù)測(cè)預(yù)后的最佳模型，使用前向和后向選擇算法進(jìn)行了多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。PSMD14、S100A11、FABP6、RBP2、LCNL1、FCN2、NDRG1、CSPG5和NR6A1被確定為OS模型中的風(fēng)險(xiǎn)基因，高風(fēng)險(xiǎn)基因與患者的預(yù)后成負(fù)相關(guān)。模型中的基因全為高風(fēng)險(xiǎn)基因（表1）。

圖1 差異表達(dá)免疫相關(guān)基因分析 A：免疫相關(guān)基因在HCC組織和癌旁組織的差異表達(dá)熱圖；B：火山圖顯示HCC組織樣品（n=377）中2 498個(gè)免疫相關(guān)基因與正常肝臟樣品（n=50）的差異表達(dá)（紅點(diǎn)代表267個(gè)上調(diào)的基因，綠點(diǎn)代表62個(gè)下調(diào)的基因，其余黑點(diǎn)表示無(wú)差異表達(dá)的基因）Figure 1 Analysis of the differentially expressed immune-related genes A: Heat map of differentially expressed genes between HCC tissue and tumor adjacent tissue; B: Volcano showing the differential expressions of 2 498 immune-related genes in HHC tissue samples(n=377) compared with normal liver tissue sample (n=50) (the red dots standing for the 267 up-regulated genes, the green dot standing for the down-regulated genes and the black dots standing for the rest genes without differential expression)

表1 HCC中9個(gè)OS高風(fēng)險(xiǎn)免疫相關(guān)基因Table 1 The 9 high-risk immune-related genes associated with the OS of HCC

2.3 基于免疫基因標(biāo)簽的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的建立與驗(yàn)證

選擇上述9個(gè)OS相關(guān)的免疫相關(guān)基因構(gòu)成基因標(biāo)簽。根據(jù)以下公式計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（0.076）×PSMD14值+（0.001）×S100A11值+（0.058）×FABP6值+（0.019）×RBP2值+（0.161）×LCNL1值+（0.028）×FCN2值+（0.006）×NDRG1值+（0.450）×CSPG5值+（0.157）×NR6A1值。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)患者進(jìn)行分類，將其分為高風(fēng)險(xiǎn)分組和低風(fēng)險(xiǎn)分組?；颊叩娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布和生存狀況如圖2A-B所示。高風(fēng)險(xiǎn)分組的病死率為48.8%，而低風(fēng)險(xiǎn)分組的病死率為26.6%。兩組之間的病死率存在明顯差異（P=2.722E-07）。Kaplan-Meier曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)分組的患者預(yù)后較差（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)：P=1.715E-08）（圖2C）。高風(fēng)險(xiǎn)分組的中位生存期為2.753年，高?；颊叩?年和5年OS率分別為48.8%和33.8%，低風(fēng)險(xiǎn)分組的中位生存期為6.937年，而低?；颊叩?、5年OS率分別為76.8%和62.7%。使用隨時(shí)間變化的ROC曲線，測(cè)量了1、3年OS的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測(cè)性能。模型樣本風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在ROC的AUC值下的面積在1、3年時(shí)分別為0.790、0.733（圖2D-E）。

對(duì)該模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，利用R語(yǔ)言將344個(gè)HCC樣本中，隨機(jī)抽取172個(gè)樣本，根據(jù)該模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)內(nèi)部驗(yàn)證樣本患者進(jìn)行分類，將其分為高風(fēng)險(xiǎn)分組和低風(fēng)險(xiǎn)分組。內(nèi)部驗(yàn)證樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布和生存狀況如圖3A-B所示。內(nèi)部驗(yàn)證樣本中，高風(fēng)險(xiǎn)分組的病死率為46.5%，而低風(fēng)險(xiǎn)分組的病死率為19.8%。兩組之間的病死率存在明顯差異（P=1.951E-04）。Kaplan-Meier曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)分組患者預(yù)后明顯差于低風(fēng)險(xiǎn)分組患者（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)：P=2.22E-05）（圖3C）。高風(fēng)險(xiǎn)分組的中位生存期為1.284年，高?；颊叩?、5年OS率分別為48.8%、36.4%，低風(fēng)險(xiǎn)分組的中位生存期超過(guò)10年，而低?；颊叩?、5年OS率分別為77.4%、62.8%。內(nèi)部驗(yàn)證樣本運(yùn)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型得到一致的生存分析結(jié)果。內(nèi)部驗(yàn)證樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在ROC的AUC值下的面積在1、3年時(shí)分別為0.799和0.743（圖3D-E），均證明此模型具有較高的準(zhǔn)確性。

C-index是在ROC曲線下面積的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，用于估計(jì)預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際觀察結(jié)果相一致的概率。在R語(yǔ)言中用C-index分析此模型的準(zhǔn)確性，在模型樣本和內(nèi)部驗(yàn)證樣本中，C-index的值分別為0.715（95%CI=0.668～0.762）和0.756（95%CI=0.683～0.829），故此風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型具有較高的準(zhǔn)確性。

圖2 模型樣本高風(fēng)險(xiǎn)分和低風(fēng)險(xiǎn)分HCC患者的分析 A：高風(fēng)險(xiǎn)分（紅色）和低風(fēng)險(xiǎn)分（綠色）患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布；B：HCC患者的生存狀況（紅點(diǎn)表示死亡的患者，綠點(diǎn)表示存活的患者）；C：高風(fēng)險(xiǎn)分（紅線）和低風(fēng)險(xiǎn)分（藍(lán)線）患者的OS的Kaplan-Meier生存曲線；D：時(shí)間依賴性ROC曲線顯示HCC患者在1年OS時(shí)的AUC值；E：時(shí)間依賴性ROC曲線顯示HCC患者在3年OS時(shí)的AUC值Figure 2 Analysis of HCC patients with high-risk score and low-risk score in the model sample A: Distribution of the patients with high-risk score (red color) and low-risk score (green color); B: Survival status of the HCC patients (the red dots standing for the dead cases and the green dots standing for the survivors); C: The OS Kaplan-Meier curves of patients with high-risk score (red line) and lowrisk score (blue line); D: Time-dependent ROC curve showing the AUC of 1-year OS of the HCC patients; E: Time-dependent ROC curve showing the AUC of 3-year OS of the HCC patients

圖3 內(nèi)部驗(yàn)證樣本中高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)HCC患者的分析 A：高風(fēng)險(xiǎn)分（紅色）和低風(fēng)險(xiǎn)分（綠色）患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布；B：HCC患者的生存狀況（紅點(diǎn)表示死亡的患者，綠點(diǎn)表示存活的患者）；C：高風(fēng)險(xiǎn)分（紅線）和低風(fēng)險(xiǎn)分（藍(lán)線）患者的OS的Kaplan-Meier生存曲線；D：時(shí)間依賴性ROC曲線顯示HCC患者在1年OS時(shí)的AUC值；E：時(shí)間依賴性ROC曲線顯示HCC患者在3年OS時(shí)的AUC值Figure 3 Analysis of HCC patients with high-risk score and low-risk score in the internal validation sample A: Distribution of the patients with high-risk score (red color) and low-risk score (green color); B: Survival status of the HCC patients (the red dots standing for the dead cases and the green dots standing for the survivors); C: The OS Kaplan-Meier curves of patients with high-risk score (red line) and low-risk score (blue line); D: Time-dependent ROC curve showing the AUC of 1-year OS of the HCC patients; E: Timedependent ROC curve showing the AUC of 3-year OS of the HCC patients

2.4 基于免疫基因標(biāo)簽的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床病理特征的關(guān)系

進(jìn)一步研究風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布與臨床參數(shù)分層之間的關(guān)系，腫瘤分級(jí)、病理分期、T分期和新腫瘤事件與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分有關(guān)（均P＜0.05）（圖4）；其他臨床特征，例如年齡、性別和腫瘤狀態(tài)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分沒(méi)有影響（均P＞0.05）。使用單變量和多變量Cox回歸來(lái)檢查風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與其他臨床病理特征的組合能力，以預(yù)測(cè)生存率。單因素Cox回歸顯示，腫瘤的T分期、病理分期和特征性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存率有關(guān)（均P＜0.05）；而多因素回歸分析顯示，只有風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與預(yù)后明顯有關(guān)，單因素與多因素分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（單因素：HR=1.057，95%CI=1.041～1.074，P＜0.001；多因素：HR=1.050，95%CI=1.033～1.067，P＜0.001），這意味著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是HCC的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（表2）。

圖4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布與臨床參數(shù)之間的關(guān)系 A：組織學(xué)分級(jí)：B：新腫瘤事件；C：病理學(xué)分期；D：T分期Figure 4 Relationship between risk score distribution and clinical factors A: Histological grade; B: New tumor events; C: Pathologic stage; D: T stage

表2 HCC患者OS的單因素和多因素Cox回歸分析。Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of OS in HCC patients

3 討 論

HCC是高度異質(zhì)性疾病[7]。數(shù)據(jù)顯示，HCC的發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)一直在增加。盡管在治療上已取得很大進(jìn)展，但HCC的總體生存率仍然很差。因此，迫切需要鑒定肝癌的敏感和特異性生物標(biāo)志物。有證據(jù)[8-9]表明，常用的臨床病理學(xué)參數(shù)（例如TNM分期，年齡，性別，病毒感染和血清AFP水平）不足以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。因此，在癌癥的發(fā)展和預(yù)后過(guò)程中，大量的mRNA被檢查并鑒定為生物標(biāo)志物。例如，Gao等[10]研究Rho鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子39（ARHGEF39）的表達(dá)及其在HCC中的預(yù)后意義。Gu等[11]發(fā)現(xiàn)CELSR3 mRNA表達(dá)在HCC中增加，提示預(yù)后不良。但是，由于這些生物標(biāo)志物會(huì)受到許多因素的影響，預(yù)測(cè)能力不穩(wěn)定。

大多數(shù)HCC發(fā)生在慢性炎癥的背景下，許多患者還伴有肝硬化，局部和全身免疫缺陷。此外，肝臟本身就是免疫器官，肝臟獨(dú)特的免疫生物學(xué)特性可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和對(duì)腫瘤的耐受性[12]，同時(shí)也為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的靶向治療提供了機(jī)會(huì)[13]。

多年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，微陣列數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)的結(jié)合被廣泛用于多種癌癥的診斷以及預(yù)后的生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)。利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)以及單變量和多變量Cox回歸分析來(lái)開(kāi)發(fā)包含各種相關(guān)基因的基因標(biāo)簽。這樣的基因標(biāo)簽被廣泛用于分子診斷，個(gè)體化治療，準(zhǔn)確的存活預(yù)測(cè)[14]，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性也優(yōu)于單一生物標(biāo)志物[15]。

因此利用生物信息學(xué)技術(shù)，建立一個(gè)與免疫相關(guān)的基因標(biāo)簽以指導(dǎo)HCC患者的治療和預(yù)后十分必要。本研究利用Immport數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出在HCC癌和癌旁差異表達(dá)的329個(gè)IRG，通過(guò)單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型來(lái)鑒定出了9個(gè)具有OS的預(yù)后價(jià)值的免疫相關(guān)基因（PSMD14、S100A11、FABP6、RBP2、LCNL1、FCN2、NDRG1、CSPG5和NR6A1），這9個(gè)基因在HCC的腫瘤組織中都是被上調(diào)，且與不良預(yù)后成正相關(guān)。利用COX回歸模型得出基因標(biāo)簽的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)分組和低風(fēng)險(xiǎn)分組。低風(fēng)險(xiǎn)分組患者的預(yù)后明顯好于高風(fēng)險(xiǎn)分組。ROC曲線、C-index分析以及內(nèi)部驗(yàn)證表明此風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)在預(yù)測(cè)HCC總生存期時(shí)具有較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)性能。此外，將臨床病理因素與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者T分期，組織學(xué)分級(jí)，以及病理學(xué)分期和是否發(fā)生新腫瘤事件等成負(fù)相關(guān)。最后，本研究進(jìn)行了單因素和多因素Cox回歸分析，以探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他臨床病理參數(shù)共同預(yù)測(cè)生存的能力。結(jié)果證實(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是一個(gè)穩(wěn)定，獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

在本研究鑒定的免疫基因標(biāo)簽中，去泛素化酶PSMD14，也稱為RPN11、POH1和PAD1，是26S蛋白酶體中19S調(diào)節(jié)帽的組成部分。已證明其參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，包括細(xì)胞生存力[16]，衰老[17]，多能性[18]，細(xì)胞自噬[19]和DNA損傷[20]。去泛素化酶PSMD14通過(guò)去泛素化和穩(wěn)定化E2F1，促進(jìn)了HCC的發(fā)生[21]。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)，PSMD14可促進(jìn)HCC細(xì)胞中TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)增加肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能與不良預(yù)后相關(guān)。S100A11是包含2個(gè)EF手鈣結(jié)合基序的S100蛋白家族的成員。該蛋白可能在運(yùn)動(dòng)，侵襲和微管蛋白聚合中起作用[23]。S100A11是偽足突出以及腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的必需蛋白之一。據(jù)報(bào)道[25]，S100A11是胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)因子[24]和結(jié)腸源性肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子。TGF-β可誘導(dǎo)肝癌中S100A11的表達(dá)[26]。Luo等[27]發(fā)現(xiàn)S100A11在肝癌中高表達(dá)，并在EGFRvIII-STAT3途徑中起著至關(guān)重要的作用，以促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。RBP2屬于JARID家族，可以使H3K4me2和H3K4me3顯著脫甲基[28]，RBP2的功能主要與癌癥的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、遷移、侵襲和細(xì)胞增殖有關(guān)。RBP2可能通過(guò)PI3K / AKT /HIF-1α信號(hào)傳導(dǎo)參與促進(jìn)VEGF表達(dá)，RBP2與VEGF協(xié)同參與了HCC腫瘤血管生成[29]。FCN2基因編碼無(wú)花果酶2（L-ficolin，F(xiàn)CN2），是一種可溶性血清蛋白，被認(rèn)為在宿主先天免疫中發(fā)揮重要作用，主要在肝臟中表達(dá)，并分泌入血液循環(huán)[30]。此外，據(jù)報(bào)道FCN2在TGF-β信號(hào)通路在調(diào)節(jié)中扮演至關(guān)重要的角色，從而參與乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和HCC等[31-32]發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。NDRG1是N-Myc下游調(diào)控的基因1，在HCC中，NDRG1通過(guò)直接與GSK-3β和Nur77相互作用來(lái)阻止β-catenin降解而成為癌基因[33]。Shi等[34]發(fā)現(xiàn)NDRG1通過(guò)抑制β-catenin的降解促進(jìn)核易位和增強(qiáng)的CSC樣特性而促進(jìn)了HCC轉(zhuǎn)移的潛力，NDRG1的上調(diào)與HCC的預(yù)后不良有關(guān)。

尚未有研究證明FABP6（回腸脂質(zhì)結(jié)合蛋白;回腸膽汁酸結(jié)合蛋白）、LCNL1（脂質(zhì)蛋白樣1）和NR6A1（孤兒受體）在肝癌中發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系。FABP6參與結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)的膽汁酸胞內(nèi)運(yùn)輸，Ohmachi等[35]發(fā)現(xiàn)了FABP6在結(jié)直腸癌中過(guò)表達(dá)，而且Keler等[36]發(fā)現(xiàn)了肝臟型脂肪酸性結(jié)合蛋白（L-FABP）在肝細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)DNA合成從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和維持細(xì)胞形態(tài)。LCNL1生物學(xué)功能涉及先天性免疫反應(yīng)，并充當(dāng)潛在有害親脂分子的生理清除劑，Yang等[37]發(fā)現(xiàn)LCNL1的高表達(dá)也顯示HER-2陽(yáng)性乳腺癌預(yù)后不良。NR6A1/CT150是一種孤兒受體，是睪丸癌（CT）抗原家族的新成員。已有研究[38-39]表明NR6A1在改變細(xì)胞命運(yùn)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，神經(jīng)發(fā)生和生殖細(xì)胞分化等方面有重要作用。Cheng等[40]研究表明NR6A1過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)DU145和PC3細(xì)胞系的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，這與前列腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不良預(yù)后密切相關(guān)。FABP6、NR6A1、LCNL1在多種癌癥中都起著重要作用，其HCC中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

目前尚未有研究闡明CSPG5在癌癥中的作用機(jī)制，CSPG5是含雞酸性亮氨酸的富含EGF樣結(jié)構(gòu)域的腦蛋白（CALEB），為硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPG）5或神經(jīng)聚糖C，是含有神經(jīng)軟骨素和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中起重要作用，Jüttner等[41]的研究表明CSPG5參與小腦γ-氨基丁酸能突觸的突觸前分化。CSPG5在其他疾病以及癌癥中的作用值得進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)HCC基因表達(dá)譜進(jìn)行了全面而新穎的分析，以識(shí)別可能在HCC患者的發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮核心作用的DEIRG。本研究的預(yù)測(cè)模型基于9個(gè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平。這種方法比全基因組測(cè)序更經(jīng)濟(jì)和臨床上可行。9基因標(biāo)簽結(jié)合臨床病理參數(shù)，可以使臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確的分析每個(gè)患者的預(yù)后。它的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)易于理解，有助于定制治療和醫(yī)療決策。

本研究可能為HCC的分子機(jī)制、免疫治療和預(yù)后的預(yù)測(cè)提供了新的見(jiàn)解。本研究構(gòu)建的新的HCC預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的優(yōu)點(diǎn)之一是：預(yù)測(cè)OS方面具有很高的敏感性和特異性，并且隨機(jī)內(nèi)部驗(yàn)證也證明其有效性。此外，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與免疫抑制環(huán)境和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)相關(guān)，從而幫助臨床醫(yī)生為HCC患者選擇個(gè)性化免疫療法。

同時(shí)，本研究也存在一些局限性。首先，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型需要在多中心臨床試驗(yàn)和前瞻性研究中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，仍需進(jìn)一步對(duì)9個(gè)免疫相關(guān)基因的功能和機(jī)理進(jìn)行解析。這些工作有待于進(jìn)一步開(kāi)展。

本文中所述的9免疫基因預(yù)后標(biāo)簽和基于該模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分先前尚未報(bào)道。因此，本研究使用生物信息學(xué)方法，篩選出由PSMD14、S100A11、FABP6、RBP2、LCNL1、FCN2、NDRG1、CSPG5和NR6A1組成的免疫相關(guān)基因標(biāo)簽，并證明其在HCC中的預(yù)后價(jià)值；該模型可以預(yù)測(cè)切除術(shù)后HCC患者的OS，可能有助于個(gè)體化治療的臨床決策。而且值得注意的是，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型提供了免疫學(xué)觀點(diǎn)，以闡明確定HCC臨床結(jié)果的機(jī)制。