蘇婷婷，鄭晉，王碩，李永盛，邊睿，施偉斌

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 普通外科，上海 200092）

膽囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是消化系統(tǒng)中發(fā)病率第6位，病死率較高的惡性腫瘤[1-3]。近年來我國膽囊癌發(fā)病率呈上升趨勢，每年新發(fā)病例數(shù)約5萬例[3]。臨床上對于膽囊癌的治療首選根治性手術(shù)切除，由于該病早期無特異臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)較晚，發(fā)現(xiàn)時常伴局部及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，隨后病情發(fā)展迅速，預(yù)后極差，因此針對膽囊癌的放、化療，分子靶向治療等綜合治療逐漸成為膽囊癌的主要治療手段[4]。隨著化療藥物在實(shí)體腫瘤中的廣泛應(yīng)用，其在晚期膽囊癌治療中起了一定作用[5-7]。目前膽囊癌的化療方案以吉西他濱+鉑類聯(lián)合化療為主[8]，盡管化療可增加腫瘤的可切除性和生存率，然而中位生存期仍不足15個月[9]，因此，尋找新的治療手段對膽囊癌的防治有重要的臨床意義。

近年來，分子靶向治療利用特異性阻斷劑干擾腫瘤細(xì)胞表達(dá)的某種信號分子，抑制腫瘤生長和侵襲，從而達(dá)到腫瘤治療效果，如用于治療胃癌的阿帕替尼[10]、治療甲狀腺癌的侖伐替尼[11]在臨床實(shí)驗(yàn)中都取得了很好的療效。目前已知與膽囊癌相關(guān)的靶點(diǎn)有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子受體（EGFR）家族等，針對這些靶點(diǎn)已有吉非替尼，厄洛替尼，貝伐珠單抗等靶向藥物進(jìn)入臨床研究，但治療效果良莠不齊[4,12]。吡咯替尼（pyrotinib）是在我國新批準(zhǔn)上市用于治療人表皮生長因子受體2（ErbB2，也稱HER-2）陽性乳腺癌的靶向化療藥物，該藥通過結(jié)合并抑制ErbB2的靶點(diǎn)，進(jìn)一步引起下游信號通路的改變抑制腫瘤細(xì)胞生長[13-14]，但目前該藥物在膽囊癌中的應(yīng)用國內(nèi)、外尚無研究報道。隨著二代基因測序技術(shù)發(fā)展，大量研究報道了膽囊癌組織存在ErbB2基因的異常表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，有實(shí)驗(yàn)研究對膽囊癌NOZ和SGC-996等細(xì)胞系進(jìn)行該基因沉默表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制[12,15-17]，這些數(shù)據(jù)顯示了ErbB2的致癌潛力，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平靶向減少該基因的表達(dá)，可初步抑制腫瘤細(xì)胞的生長，因此本研究探討吡咯替尼對膽囊癌細(xì)胞株的殺傷作用，并為進(jìn)一步研究其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

吡咯替尼原藥由江蘇恒瑞股份有限公司提供。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于生工生物工程（上海）股份有限公司。為進(jìn)行體外研究，先將吡咯替尼溶解在DMSO中，生成濃度為100 mmol/L的儲備液。對于工作液濃度，是將藥物儲備溶液用培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋產(chǎn)生。對照組是用等體積的DMSO處理。最終處理組和對照組需保持細(xì)胞培養(yǎng)基中DMSO濃度在0.1%以下。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖型Dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基購于Gbico公司，penicillin-streptomycin雙抗購于Hyclone公司，0.25%EDTA胰酶購于蘇州新賽美生物科技有限公司，Transwell小室含和不含基質(zhì)膠型均購于上海百賽生物技術(shù)公司，Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）購于上海翊圣生物科技有限公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、SDS（sodium dodecyl sulfate）-page快速配膠盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)公司。Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP和二抗（山羊抗兔）購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用于本研究的NOZ和SGC-996膽囊癌細(xì)胞株由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院普外科實(shí)驗(yàn)室保存，兩種細(xì)胞系均在DMEM高糖型培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加了10%的胎牛血清，100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素。所有細(xì)胞均在37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活力和毒性實(shí)驗(yàn) 對于細(xì)胞活力的測定，按照CCK-8試劑制造商的操作說明進(jìn)檢測。取處于對數(shù)生長期的NOZ、SGC-996細(xì)胞，0.25% EDTA胰酶消化離心，重懸計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)2×103個。在96孔板中處理組共設(shè)6個組，工作液終濃度分別為0、1、2、4、6、8 μmol/L 的吡咯替尼處理 24、48、72 h，用含濃度為0.1%的DMSO溶媒作為對照組，每個分組設(shè)置3個副孔。處理相應(yīng)時間后，將10 μL CCK-8試劑添加到每個孔中，并在37 ℃下避光進(jìn)一步孵育4 h，隨后通過酶標(biāo)儀（Bio-Tek，Winooski，VT，USA）測定在450 nm波長處吸光度值（OD），算得細(xì)胞存活率和25%（IC50）、50%（IC50）、75%（IC75）抑制濃度。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)測結(jié)果，選取最適時間下吡咯替尼對兩種細(xì)胞相應(yīng)的IC50、IC50、IC75抑制濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理濃度。對于平板克隆實(shí)驗(yàn)，將處于對數(shù)生長期的NOZ細(xì)胞和SGC-996細(xì)胞接種在6孔板中，每孔1×104個細(xì)胞，用上述濃度的吡咯替尼處理細(xì)胞，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，PBS洗滌2遍，胰酶消化離心，重懸計(jì)數(shù)，接種于新鮮培養(yǎng)基覆蓋的6孔板中，每孔接種500個細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)14 d，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定，隨后0.1%結(jié)晶紫染色，最后拍照計(jì)數(shù)，處理圖片數(shù)據(jù)。

1.2.4 遷移侵襲實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)期生長的NOZ和SGC-996細(xì)胞，胰酶消化離心，重懸計(jì)數(shù)后接種在6孔板中，待細(xì)胞長到融合度為70%左右時用前述濃度處理細(xì)胞12 h后，棄去培養(yǎng)基，胰酶消化離心，重懸計(jì)數(shù)細(xì)胞，將1×105個NOZ和SGC-996細(xì)胞接種在裝有200 μL的無血清培養(yǎng)基Transwell（8.0 μm孔徑）的上室（遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室上室底不含基質(zhì)膠，侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell小室上室底含基質(zhì)膠）中培養(yǎng)。下室盛有300 μL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，甲醇固定，并用結(jié)晶紫染色后在熒光顯微鏡下觀察拍照，每組小室隨機(jī)選擇3個區(qū)域進(jìn)行拍照定量分析。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 用吡咯替尼處理NOZ、SGC-996細(xì)胞（處理濃度如前所述）48 h以評估細(xì)胞凋亡率，孵育結(jié)束后，培養(yǎng)基連同PBS洗滌1次后的液體一并與胰酶消化后細(xì)胞收集起來1 000r/min離心5 min，再用PBS洗滌一遍離心后棄上清，隨后加入195 μL Annexin V結(jié)合液，5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶混勻，室溫下避光孵育20 min，上機(jī)檢測。

1.2.6 Western blot分析 NOZ和SGC-996細(xì)胞用吡咯替尼按前述濃度處理48 h后，用預(yù)混蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，超聲10 s，4 ℃，14 000r/min 離心10 min，用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。每組40 μg蛋白樣品加入上樣孔，在SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后將膜與Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP、及內(nèi)參抗體tubulin（1:2 000）4 ℃孵育過夜。后將膜與相應(yīng)二抗在室溫下孵育1 h，洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)資料結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)用于比較處理組和對照組之間的差異，單因素方差分析用于多組間比較，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Graphpad軟件及Image J軟件進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié) 果

2.1 吡咯替尼抑制膽囊癌細(xì)胞增殖

用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測吡咯替尼對NOZ、SGC-996細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示。用吡咯替尼處理24、48、72 h后的NOZ、SGC-996細(xì)胞的活力隨處理濃度增加，細(xì)胞活力逐漸下降，同時隨著吡咯替尼作用時間延長，細(xì)胞活力呈明顯下降趨勢（圖1）。在加藥后48 h，細(xì)胞抑制率隨加藥濃度升高從20%升高到70%；對于NOZ和SGC-996細(xì)胞在24、48、72 h的IC50分別為11.5、3.6、1.4 μmol/L和5.5、5.2、2.4 μmol/L。按既定方案，后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理NOZ細(xì)胞的藥物濃度為1、3.5、12 μmol/L；處理SGC-996細(xì)胞的藥物濃度為2.5、5、10 μmol/L。

圖1 吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細(xì)胞的抑制的時間、濃度效應(yīng)Figure 1 The time and concentration inhibitory effect of pyrotinib on gallbladder cancer cells

2.2 吡咯替尼對膽囊癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)以測定單細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，吡咯替尼處理48 h更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d后引起膽囊癌細(xì)胞集落形成能力呈現(xiàn)濃度依賴性降低，此外，各濃度吡咯替尼處理處理組中形成的集落數(shù)量和大小均明顯小于對照組（均P＜0.05）（圖2）。

圖2 吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細(xì)胞克隆形成的抑制作用Figure 2 Inhibitory effects of pyrotinib on clone formation abilities of gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

2.3 吡咯替尼對膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用

Transwell小室實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，與對照組相比，用吡咯替尼處理12 h后，穿過帶基質(zhì)膠和不帶基質(zhì)膠的Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)隨處理濃度增加而減少（均P＜0.05）（圖3）。

2.4 吡咯替尼誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞發(fā)生凋亡

為探討吡咯替尼對膽囊癌細(xì)胞凋亡的影響，用前述濃度處理膽囊癌細(xì)胞NOZ、SGC-996 48 h后，使用流式細(xì)胞儀分析了細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，在雙參數(shù)散點(diǎn)圖中，LL象限代表活細(xì)胞，LR和UR象限分別代表早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞。隨著吡咯替尼處理濃度的增加，存活的細(xì)胞百分比減少，而早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)均增加（均P＜0.05）（圖4）。

為了進(jìn)一步研究吡咯替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過Western blot檢測了caspase家族，Bcl-2家族和其他在凋亡過程中期起關(guān)鍵作用的重要蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，吡咯替尼增加了cleavedcaspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP和Bax的表達(dá)，同時降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。此外，Bcl-2與Bax的比例呈濃度依賴性降低趨勢（均P＜0.05）（圖5）

圖3 吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細(xì)胞侵襲和遷移影響Figure 3 Effects of pyrotinib on invasion and migration of gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

圖4 流式分析吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Flow cytometric analyzing the effects of pyrotinib on the apoptosis of gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

圖5 Western blo檢測吡咯替尼對膽囊癌NOZ、SGC-996細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Western blot analyzing the effects of pyrotinib on the expressions of the apoptosis-related proteins in gallbladder cancer NOZ and SGC-996 cells

3 討 論

迄今為止發(fā)現(xiàn)的與膽囊惡性腫瘤相關(guān)的癌基因有KRAS、TP53、Myc、ErbB2等[15-16,18]，相關(guān)的信號通路有ErbB、angiogenesis、Hedgehog、PI3K/Akt/mTOR、MAPK/ERK[12,19-21]等，這些癌基因和相關(guān)信號通路及關(guān)鍵分子的異常表達(dá)和調(diào)控紊亂，參與了膽囊癌的發(fā)生與發(fā)展。其中又以ErbB家族及其信號通路的研究報道較多。ErbB家族一共包含了EGFR、ErbB2、HER-3及HER-4該4個酪氨酸激酶受體，這些受體與相應(yīng)配體結(jié)合后，引起下游基因突變或擴(kuò)增，調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等[12,22]。現(xiàn)有報道稱20%的非小細(xì)胞肺癌存在EGFR突變，大約有20%的乳腺癌患者存在ErbB2基因的擴(kuò)增[22]，而針對膽囊癌進(jìn)行的基因檢測及全外顯子測序[12,15-17,23-24]結(jié)果顯示ErbB2基因有擴(kuò)增突變，引起ErbB信號通路改變，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[16]，這些異常的基因改變使之成為疾病不良預(yù)后的關(guān)鍵分子和治療靶點(diǎn)。

因此，隨著分子靶向治療策略的提出，靶向治療藥物被大量開發(fā)，廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體瘤中的治療。如針對于腫瘤血管生成和細(xì)胞增殖的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶受體抑制劑侖伐替尼在原發(fā)性肝癌和甲狀腺癌中的應(yīng)用，高選擇性VEGFR-2激酶抑制劑阿帕替尼在胃癌中的應(yīng)用，靶向小分子蛋白激酶抑制劑奧斯替尼用于轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌一線治療，以及ErbB2抑制劑拉帕替尼在乳腺癌中的應(yīng)用都取得了良好的臨床效果[10,11,22,25-27]。小分子酪氨酸激酶抑制劑吡咯替尼，是我國新批準(zhǔn)的用于治療ErbB2陽性乳腺癌的靶向化療藥物，在目前的臨床研究結(jié)果中，吡咯替尼表現(xiàn)出良好的耐受性、安全性[28]，甚至有報道稱臨床療效超過了拉帕替尼[29]，為吡咯替尼在膽囊癌的應(yīng)用提供了可能性。

在本研究中，用吡咯替尼處理膽囊癌細(xì)胞NOZ和SGC-996，隨后CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖情況，結(jié)果說明吡咯替尼能夠明顯抑制膽囊癌細(xì)胞的活力，抑制效果因不同細(xì)胞系而有差異，如吡咯替尼抑制NOZ細(xì)胞系的效果隨時間延長呈現(xiàn)平緩均勻的速度；對于SGC-996細(xì)胞系，用吡咯替尼處理前24、48 h的抑制效果變化不大，而到72 h抑制效果突然增加。接著進(jìn)行的克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了吡咯替尼有抑制膽囊癌細(xì)胞增殖的作用，并且對NOZ細(xì)胞系的效果明顯。出現(xiàn)以上結(jié)果可能原因是ErbB2的在該兩種細(xì)胞中表達(dá)量不同。Transwell實(shí)驗(yàn)表明了吡咯替尼對膽囊癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

拉帕替尼在治療ErbB2/HER-2陽性乳腺腫瘤時可誘導(dǎo)增強(qiáng)體外細(xì)胞凋亡[28]。細(xì)胞凋亡是由一些列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控等作用引起細(xì)胞的程序性的死亡，該過程可維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用[30-32]。為此，我們用吡咯替尼處理膽囊癌細(xì)胞后進(jìn)行流式分析，通過檢測早期和晚期凋亡細(xì)胞率發(fā)現(xiàn)吡咯替尼可誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴方式。凋亡的發(fā)生由多種通路途徑控制，最常見凋亡通路核心分子家族成員是Bcl-2家族和caspase家族[33]，細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，Bax、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-PARP表達(dá)增加，對細(xì)胞凋亡起到促進(jìn)作用，而另一方面，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)會降低[34-35]，事實(shí)也是如此，本研究通過Western blot分析最后得到的蛋白條帶變化與既往研究一致，即隨著吡咯替尼處理膽囊癌NOZ、SGC-996細(xì)胞系濃度增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，Bax蛋白表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2/Bax比值明顯減小，相對的，cleaved-caspase 3、cleavedcaspase 9、cleaved-PARP蛋白表達(dá)量顯著增加。以上研究結(jié)果顯示，吡咯替尼可以促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制與誘導(dǎo)凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)和抑制抗凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上，吡咯替尼能夠通過增加凋亡蛋白表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮對膽囊癌細(xì)胞株NOZ、SGC-996的殺傷作用，為膽囊癌的治療提供了新的選擇及一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但該藥對臨床膽囊癌患者療效及安全性尚待進(jìn)一步的研究，隨著后期體內(nèi)及臨床試驗(yàn)的開展，可進(jìn)一步評估該藥物對膽囊癌患者的靶向治療作用，并可能最終改善膽囊癌患者預(yù)后。