高楊 叢力寧 程毅 劉巖

黑色素瘤是一種好發(fā)于皮膚的高度惡性的腫瘤，有易發(fā)生轉(zhuǎn)移，病死率高，預(yù)后差[1,2]等特點(diǎn)，且缺乏較有效的治療手段。斑蝥素是從斑蝥的干燥蟲(chóng)體中提取的一種抗腫瘤活性成分，具有抗腫瘤、升白細(xì)胞、增強(qiáng)免疫、抗病毒、抑菌及抗氧化等作用，臨床上可用于治療多種腫瘤。去甲斑蝥素是斑蝥素的衍生物，由人工合成，其毒副作用比斑蝥素低，具有獨(dú)特的升白細(xì)胞作用及較強(qiáng)的抗癌作用。本研究通過(guò)去甲斑蝥素作用于人黑色素瘤M14細(xì)胞，觀察去甲斑蝥素對(duì)M14細(xì)胞凋亡和有關(guān)凋亡基因及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響，探討其可能的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人M14黑素瘤細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；去甲斑蝥素購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，CCK8試劑購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所，Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司、高效RIPA裂解液購(gòu)于北京索萊寶來(lái)生物技術(shù)有限公司，PCR引物購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：M14細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞融合達(dá)到90%以上時(shí)，按1∶2或1∶3的比例進(jìn)行傳代。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和50、100、500 μg/L去甲斑蝥素給藥組。

1.2.2 CCK8檢測(cè)：細(xì)胞活性將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M14細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μl的藥物，濃度分別為0、50、100、500 μg/L，只加培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞孔為空白對(duì)照組。分別作用12、24 h后，加CCK8每孔10 μl作用2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔450 nm波長(zhǎng)的吸光度值并計(jì)算抑制率。生長(zhǎng)抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá)

1.2.3.1 Trizol法提取細(xì)胞總RNA：貼壁細(xì)胞PBS洗滌3次，加入1 ml Trizol，吹打充分混勻，移至EP管，冰盒靜置5 min，加入0.2 ml氯仿，上下劇烈震蕩15 s，冰盒靜置5 min，2 min，4℃離心，12 000 r/min×15 min，取上層水相移入一新無(wú)RNase管中，加入等體積異丙醇，冰盒靜置10 min，4℃離心，12 000 r/min×10 min。棄上清，管中白色沉淀即RNA，去除殘液后加入0.4 ml 75%乙醇洗滌，4℃離心，9 000 r/min×5 min，棄上清，晾干RNA。加入40 μl ddH2O溶解，吹打混勻，-80℃保存。

1.2.3.2 總RNA質(zhì)量的檢測(cè):測(cè)定RNA樣品的OD260及OD280，計(jì)算RNA的濃度，以O(shè)D260/OD280，保證其比值在1.9～2.0，若偏差過(guò)大，則表示RNA有污染，判斷RNA樣品中有無(wú)蛋白質(zhì)或者有機(jī)溶劑污染。

1.2.3.3 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。見(jiàn)表1。

表1 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA反應(yīng)體系

1.2.3.4 qRT-PCR GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，總體積為20 μl。充分混勻，操作IQ5軟件：熱學(xué)過(guò)程：95℃×5 min，95℃×15 s，58℃×30 s，72℃×30 s，共40個(gè)重復(fù)循環(huán)，采集PCR產(chǎn)物熒光值。結(jié)束后，設(shè)置溶解曲線程序：95℃×15 s，60℃～95℃，緩慢升溫，產(chǎn)生熔點(diǎn)曲線或稱解離曲線。設(shè)閾值，檢測(cè)mRNA的表達(dá)情況。見(jiàn)表2。

表2 qRT-PCR GAPDH為內(nèi)參反應(yīng)體系

1.2.3.5 引物序列:見(jiàn)表3。

表3 引物序列

1.2.4 雙重加熱法檢測(cè)MDA的水平。其實(shí)驗(yàn)原理基于硫代巴比妥(TBA)和MDA反應(yīng)產(chǎn)生的紫色，通過(guò)比色法間接測(cè)定MDA的水平。調(diào)整M14細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)，接種于6孔板，37℃、5% CO2溫箱中孵育過(guò)夜。加入不同濃度的去甲斑蝥素后孵育24 h后離心收集細(xì)胞。加入200 μl細(xì)胞裂解液充分裂解后,1 600 r/min離心10 min取上清，按照試劑盒的操作說(shuō)明，加入TBA溶液，95℃煮沸40 min。樣品迅速冷卻至室溫，并按要求加入96孔板中，在532 nm酶標(biāo)儀測(cè)定吸光光度值。MDA含量為每毫克蛋白質(zhì)中的納摩爾數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)：DCFH-DA被自由基(H2O2)去乙?；D(zhuǎn)變?yōu)槠錈晒猱a(chǎn)物DCF，通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光值，可間接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。調(diào)整M14細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)，接種于6孔板，37℃、5% CO2溫箱中孵育過(guò)夜。加入不同濃度的去甲斑蝥素后孵育24 h后收集細(xì)胞。按照活性氧檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明，用DCFH-DA 熒光探針標(biāo)記細(xì)胞，利用熒光酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定不同組別中DCF 的熒光值。

2 結(jié)果

2.1 去甲斑蝥素抑制M14細(xì)胞增殖 CCK8結(jié)果所示，去甲斑蝥素可抑制黑素瘤M14細(xì)胞的增殖，藥物作用24 h后各組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較有顯著差異(F=135.76，P<0.05)，作用48 h后亦有顯著差異(F=96.12，P<0.05)，經(jīng)兩兩比較，各濃度去甲斑蝥素與陰性對(duì)照組組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

組別24 h凋亡率48 h凋亡率對(duì)照組 6.34±1.037.86±1.3750 μg/L NCTD 14.57±1.45?18.89±2.13?100 μg/L NCTD38.48±2.67?#46.18±3.06?#500 μg/L NCTD56.72±3.78?#△63.57±3.64?#△

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與50 μg/L NCTD比較，#P<0.05；與100 μg/L NCTD比較，△P<0.05

2.2 去甲斑蝥素對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響 采用RT-PCR法檢測(cè)去甲斑蝥素對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞中凋亡基因mRNA的影響。去甲斑蝥素作用M14細(xì)胞24、48 h后，均能夠升高凋亡相關(guān)基因Bax、caspase-3、caspase-9、細(xì)胞色素c的mRNA的表達(dá)，減少凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

組別Bax相對(duì)mRNAcaspase-3相對(duì)mRNAcaspase-9相對(duì)mRNA細(xì)胞色素c相對(duì)mRNABcl-2相對(duì)mRNA對(duì)照組 1111150 μg/L NCTD1.11±0.251.07±0.181.05±0.030.83±0.110.83±0.08100 μg/L NCTD1.32±0.0451.74±0.09#1.34±0.05#1.18±0.06?0.60±0.16#500 μg/L NCTD1.47±0.085?1.74±0.38#1.42±0.04#1.25±0.08#0.40±0.11#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.3 去甲斑蝥素對(duì)M14細(xì)胞中ROS的影響經(jīng)過(guò)藥物處理人M14黑色素瘤細(xì)胞24 h后，采用熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素作用在人M14黑色素瘤細(xì)胞ROS水平。如圖3顯示結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素能明顯的提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平(F=22.029，P<0.05)，與對(duì)照組對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖1。

組別ROS相對(duì)含量對(duì)照組 150 μg/L NCTD 1.31±0.035?100 μg/L NCTD1.25±0.04?500 μg/L NCTD1.34±0.10?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

圖1 熒光探針?lè)z測(cè)去甲斑蝥素對(duì)黑素瘤M14細(xì)胞ROS的影響

2.4 去甲斑蝥素對(duì)M14細(xì)胞中MDA的影響經(jīng)過(guò)不同濃度藥物處理人M14黑色素瘤細(xì)胞24 h后，采用雙重加熱法檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素作用在人M14黑色素瘤細(xì)胞后的MDA水平。去甲斑蝥素能明顯的提高細(xì)胞內(nèi)MDA水平(F=14.230，P<0.05)，且呈劑量依賴性。與對(duì)照組相比，100 μg/L、500 μg/L 2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表7，圖2。

組別MDA對(duì)照組 0.31±0.0450 μg/L NCTD 0.56±0.10100 μg/L NCTD0.88±0.13?500 μg/L NCTD0.99±0.23#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

圖2 雙重加熱法檢測(cè)去甲斑蝥素對(duì)黑素瘤M14細(xì)胞丙二醛(MDA)的影響

3 討論

去甲斑蝥素(noncantharidin，NCTD)為斑蝥素的衍生物，是人工合成的一種新型抗癌藥物，是一種水溶性合成小分子，與斑蝥素相似，其摩爾質(zhì)量、復(fù)雜度和重原子數(shù)分別為168.15 g/mol、246和12。NCTD可以引起多種細(xì)胞系的凋亡，目前已有研究表明去甲斑蝥素對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞[1]、骨髓瘤U266細(xì)胞[2]、肺腺癌A549細(xì)胞[3]、胰腺癌PANC1細(xì)胞[4]、胃癌SGC7901細(xì)胞[5]、乳腺癌MCF7細(xì)胞[6]等均具有抑制作用。此外，它還可以抑制血管的生成和轉(zhuǎn)移，影響控制細(xì)胞增殖的多種途徑。

目前，包括Wnt/β-連環(huán)蛋白，Sonic hedgehog(Shh)和Notch信號(hào)通路在內(nèi)的幾種途徑已被確定在癌癥干細(xì)胞的自我更新中起到關(guān)鍵作用，并可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和多藥耐藥，以及血管生成，遷移，侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。去甲斑蝥素可以促進(jìn)β-catenin活化的喪失并抑制具有顯性β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞的增殖[8]；NCTD可抑制了乳腺癌各種細(xì)胞系的Shh表達(dá)[9]；NCTD劑量依賴性地抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中Akt和NF-κB表達(dá)的磷酸化[10]。此外，NCTD在低濃度(0.2～0.8 μg/ml)下使人肺癌A549細(xì)胞遷移減少超過(guò)65%而不影響細(xì)胞活力[11]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)，c-Jun NH2-末端激酶(JNK)的激活和下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)節(jié)參與NCTD誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡[12]；這表明NCTD具有用活化的Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑治療癌癥的顯著潛力。在對(duì)單一藥物或一類藥物產(chǎn)生耐藥性后，癌細(xì)胞對(duì)其他功能和結(jié)構(gòu)不相關(guān)的藥物表現(xiàn)出交叉耐藥性，導(dǎo)致癌細(xì)胞治療失敗，這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)。盡管目前已研究了MDR的許多機(jī)制，但最重要的機(jī)制可能是通過(guò)細(xì)胞膜上藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將藥物主動(dòng)移出從而減少細(xì)胞內(nèi)藥物積累。這些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為ATP結(jié)合蛋白，包括p-糖蛋白，多藥耐藥蛋白1、多藥耐藥蛋白2，肺耐藥蛋白、和乳腺癌耐藥蛋白等[7]。NCTD可抑制異質(zhì)性人上皮結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞單層模型中p-糖蛋白[13]和多藥耐藥相關(guān)蛋白2的表達(dá)[14]，誘導(dǎo)對(duì)多種化療藥物具有耐藥性的口腔癌細(xì)胞的凋亡[15]。在對(duì)多柔比星耐藥的人乳腺癌MCF-7R細(xì)胞的研究中，NCTD增加了MCF-7R細(xì)胞中多柔比星的細(xì)胞內(nèi)積累，并抑制了多藥耐藥蛋白1 mRNA，p-糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白表達(dá)的上調(diào)[16]?？偟膩?lái)說(shuō)，NCTD可能是P-糖蛋白的底物，可能會(huì)克服癌細(xì)胞的多藥耐藥性。本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)研究中，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到去甲斑蝥素對(duì)人A375細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK8法分析去甲斑蝥素體外作用于人黑色素瘤M14細(xì)胞，結(jié)果顯示去甲斑蝥素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并且呈時(shí)間-劑量依賴性。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們還通過(guò)DAPI染色法通過(guò)熒光顯微鏡下觀察去甲斑蝥素對(duì)黑素瘤M14細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、核邊集及凋亡小體等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，證實(shí)去甲斑蝥素對(duì)人黑色素瘤M14細(xì)胞有抑制作用，但其作用機(jī)制尚不明確[17]。在本試驗(yàn)中，我們研究了去甲斑蝥素是否可以在M14細(xì)胞中激活線粒體途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是發(fā)生在多細(xì)胞生物中的程序性細(xì)胞死亡的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程包括起泡，細(xì)胞收縮，核碎裂，染色質(zhì)濃縮，染色體DNA片段化和mRNA全面衰變[18]?；诖碳ひ蛩氐牟煌?，細(xì)胞凋亡通常通過(guò)激活外源性(死亡受體)途徑或內(nèi)在(線粒體)途徑。內(nèi)源性途徑通常被來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)部的壓力激活，由一連串的刺激因素誘導(dǎo)，包括DNA損傷和生長(zhǎng)因子減少，這些刺激信號(hào)最終觸發(fā)線粒體外膜通透性增加(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)。其中線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)通透性增加一般是由于某些促凋亡BCL-2家族成員激活的結(jié)果[19]。Bcl-2家族包括凋亡抑制因子和凋亡促進(jìn)因子兩大類，凋亡抑制因子包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等，Bax、Bak、Bcl-xS等為凋亡促進(jìn)因子。Bax與Bcl-2是一對(duì)同源或者異源二聚體，當(dāng)細(xì)胞DNA受損時(shí)，Bax表達(dá)增強(qiáng)，可與Bcl-2形成同源二聚體，拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，從而激活線粒體凋亡通路，引起細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道，ROS可作為細(xì)胞的第二信使調(diào)控細(xì)胞增長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖，但是過(guò)高的ROS水平會(huì)使細(xì)胞因氧化過(guò)度而受損，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。ROS介導(dǎo)的細(xì)胞損傷在早期會(huì)引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)伴有MDA的產(chǎn)生，因此MDA可間接評(píng)價(jià)細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷的嚴(yán)重程度[21]。在前期的研究中，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10～40 μmo/L去甲斑蝥素作用在人A375黑色素瘤細(xì)胞48 h后，ROS水平明顯有所提高，且呈劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步通過(guò)熒光探針?lè)z測(cè)去甲斑蝥素對(duì)M14黑素瘤細(xì)胞ROS的影響，結(jié)果顯示去甲斑蝥素同樣可增加M14細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的MDA水平也升高，間接反映了細(xì)胞受到了過(guò)度的氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)，通過(guò)RT-PCR我們還發(fā)現(xiàn)，隨著去甲斑蝥素濃度的升高，凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Capase-9、Bax、細(xì)胞色素c基因的mRNA表達(dá)量逐漸升高，而凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表達(dá)量逐漸降低。綜合以上結(jié)果，我們推測(cè)去甲斑蝥素可誘導(dǎo)M14細(xì)胞凋亡，其作用可能與去甲斑蝥素引發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激進(jìn)而啟動(dòng)線粒體途徑的凋亡通路有關(guān)，去甲斑蝥素有望成為治療黑素瘤的有效輔助性藥物。