邱明亮，朱衛(wèi)娜，莫麗莎，徐衛(wèi)東，高 波

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 南昌 330006；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科 南昌 330006；3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科 南昌 330006；4. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 常州 213003）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種在成人當(dāng)中常見的以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯南到y(tǒng)性、炎癥性自身免疫性疾病，全球約有1%的人群受其累[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于本病的研究，雖取得了長足的進(jìn)步，但仍有部分患者誤診或延后診斷，錯過了最佳治療窗。需不斷探討新的生物標(biāo)志物，以更明確的診斷本病。我國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病是風(fēng)寒濕邪客于關(guān)節(jié)，氣血痹阻，導(dǎo)致以小關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵為特點(diǎn)的疾病，屬于“尪痹”“痹證”“歷節(jié)”等范疇。中醫(yī)藥治療本病，限于證候客觀化研究的不足，作為臨床治療核心理念的“辨證論治”，無法充分發(fā)揮其指導(dǎo)作用。尋找客觀化指標(biāo)，以指導(dǎo)“病”“證”的診斷，成為了中醫(yī)藥治療本病研究的重中之重。

作為表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，miRNAs 是真核生物內(nèi)源性基因編碼的、長度為18-25 堿基的單鏈非編碼RNA。既往研究表明，miRNA 在固有免疫、適應(yīng)性免疫及炎性因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。Chen Z 等[4]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)細(xì)胞來源的miRNA-150-5p 可通過靶向結(jié)合于基質(zhì)金屬蛋白和血管內(nèi)皮生長因子，減少類風(fēng)濕成纖維樣滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制微管的形成。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子（SOCS）是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的經(jīng)典抑制劑，由至少8種成分組成，即SOCS1-7 和CIS。其中SOCS1 在免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[5]。Egan 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在mBSA-和IL-1誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，相對于野生型小鼠，SOCS1-/-小鼠更易產(chǎn)生急性關(guān)節(jié)炎。De Hooge 等[7]在酵母聚糖誘導(dǎo)的大鼠模型中，證明缺乏STAT1 的炎癥性滑膜中，SOCS1 的水平明顯下降。提示miRNA-150-5p、SOCS1 mRNA 可能參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程。

Zhou H 等[8]報(bào)道，過表達(dá)的miR-150-5p 可顯著降低狼瘡性腎炎的近端腎小管和系膜細(xì)胞中SOCS1 的表達(dá)，提示miR-150-5p 通過下調(diào)SOCS1 來增加促纖維化分子，從而促進(jìn)腎纖維化。這說明SOCS1與miR-150-5p 關(guān)系密切。RA 患者中，SOCS1 與miR-150-5p是否存在靶向結(jié)合關(guān)系，兩者是否可作為RA 診斷的生物標(biāo)志物，值得深入探討。

本研究擬基于miR-150-5p及SOCS1 mRNA，初步探討兩者在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)以及對西醫(yī)疾病和中醫(yī)證型判斷的指導(dǎo)意義，以期為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎“病”“證”的診斷提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為自2018 年5 月至2018 年12 月，江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科門診和住院部就診的57 例RA 患者，我院健康體檢中心的19 例健康對照者（health control，HC）。本研究已獲我院倫理委員會審議通過。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2010 年ACR/EULAR 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)[9]；②年齡≥18 歲，且≤80 歲；（③受試者知情同意，并簽署了知情同意書。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>80 歲或<18 歲者；②晚期嚴(yán)重關(guān)節(jié)畸形、功能喪失的患者；③妊娠或哺乳期女性患者、精神病患者；④有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；⑤精神病患者。

1.2 方法

1.2.1 檢測指標(biāo)及方法

所有受試者均記錄年齡、性別，并測定血常規(guī)、肝功能、腎功能。同時，所有RA 患者均記錄患者發(fā)病年齡、病程、用藥史及合并疾病，且均采用qPCR 法進(jìn)行miR-150-5p、SOCS1 mRNA 等測定，采用雙熒光素酶方法判斷兩者是否存在靶向結(jié)合關(guān)系。

（1）miR-150-5p測定

采集受試者外周血全血10 ml，EDTA-K2抗凝，取淋巴細(xì)胞分離液分離，加入2 ml Trizon（CW0580S，CWBIO），渦旋混勻；采用miRNA 提取試劑盒（CW0627S，CWBIO）提取總RNA；采用紫光光度計(jì)測定mRNA 濃度、純度；采用miRNA cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（CW2141S，CWBIO）逆轉(zhuǎn)錄cDNA；應(yīng)用miRNA qPCR Assay Kit（CW2142S，CWBIO），按照Ul?tra SYBR Mixture（CW0957M，CWBIO）操作流程進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以U6 為內(nèi)參，檢測miR-150-5p 的表達(dá)水平。MiR-150-5p及U6引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。U6 上游引物：GCTTCGGCAGCA?CATATACTAAAAT；Hsa-mir-150-5p 上 游 引 物：TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG。每個標(biāo)本均做3 個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線分析。熒光定量PCR 的結(jié)果以每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)C（T）表示，C（T）值越大，參與反應(yīng)的起始模板量就越少，反之則越多。miRNA-150-5p 與U6相對表達(dá)量用2-ΔΔCT值表示[10]。

（2）SOCS1 mRNA測定

外周血預(yù)處理同前；采用RNA 提取試劑盒（CW0581M，CWBIO）提取總RNA；采用紫光光度計(jì)測定RNA 濃度、純度；采用HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（CW2569M，CWBIO）逆轉(zhuǎn)錄CDNA；按照Ultra?SYBR Mixture（CW0957M，CWBIO）操作流程進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測SOCS1 mRNA 的表達(dá)水平。SOCS1 及GAPDH 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。GAPDH 上游引物：GAAGGTCG?GAGTCAACGGAT；SOCS1 上游引物：CGCACTTCCG?CACATTC。每個標(biāo)本均做3 個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線分析。熒光定量PCR 的結(jié)果以每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)C（T）表示，C（T）值越大，參與反應(yīng)的起始模板量就越少，反之 則 越 多。SOCS1 與GAPDH 相 對 表 達(dá) 量 用2-ΔΔCT值表示[10]。

表1 一般資料比較

（3）雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

充分裂解293T 細(xì)胞后，12000 g 離心2 分鐘，取上清；取100μL平衡至室溫的Luciferase substrate加入檢測管酶標(biāo)板中，小心吸取20μL 細(xì)胞裂解上清至酶標(biāo)板中，迅速混勻后迅速于酶標(biāo)儀中檢測Firefly lucifer?ase 報(bào)告基因活性；在以上反應(yīng)液中加入100 μL 新配置的Renilla 底物工作液，迅速混勻后立即于酶標(biāo)儀中檢測Renilla luciferase 報(bào)告基因活性。在以Renilla 熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU 值除以Renilla 熒光素酶測定得到的RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣本間目的報(bào)告基因的激活程度。

（4）其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測定

均在江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。血常規(guī)采用血細(xì)胞分析儀（SYSMEX，XE-2100）檢測，肝功能、腎功能采用全自動生化分析儀（Roche，P 800）檢測。

1.2.2 中醫(yī)辨證分型

所有RA患者均參照國家中醫(yī)藥管理局2010年發(fā)布的《22 個專業(yè)95 個病種中醫(yī)診療方案》進(jìn)行中醫(yī)辨證分型[11]。具體癥候包括：①風(fēng)濕痹阻證：肢體關(guān)節(jié)疼痛、重著，或有腫脹，痛處游走不定，關(guān)節(jié)屈伸不利，舌質(zhì)淡紅，苔白膩，脈濡或滑；②寒濕痹阻證：肢體關(guān)節(jié)冷痛，局部腫脹、屈伸不利，關(guān)節(jié)拘急，局部畏寒，得寒痛劇，得熱痛減，皮色不紅，舌胖，舌質(zhì)淡暗，苔白膩或白滑，脈弦緩或沉緊；③濕熱痹阻證：關(guān)節(jié)腫痛，觸之灼熱或有熱感，口渴不欲飲，煩悶不安，或有發(fā)熱，舌質(zhì)紅，苔黃膩，脈濡數(shù)或滑數(shù)；④痰瘀痹阻證：關(guān)節(jié)腫痛日久不消，晨僵，屈伸不利，關(guān)節(jié)周圍或有皮下結(jié)節(jié)，舌暗紫，苔白厚或厚膩，脈沉細(xì)澀或沉滑；⑤氣血兩虛證：關(guān)節(jié)肌肉酸痛無力，活動后加劇，或肢體麻木，筋惕肉瞤，肌肉萎縮，關(guān)節(jié)變形，少氣乏力，自汗，心悸，頭暈?zāi)垦?，面黃少華，舌淡苔薄白，脈細(xì)弱；⑥肝腎不足證：關(guān)節(jié)肌肉疼痛，腫大或僵硬變形，屈伸不利，腰膝酸軟無力，關(guān)節(jié)發(fā)涼，畏寒喜暖，舌紅，苔白薄，脈沉弱。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0 計(jì)量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比（%）表示；分類資料組間比較采用x2檢驗(yàn)。計(jì)量資料兩兩比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)（方差不齊釆用秩和檢驗(yàn)），組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）；ROC曲線分析miR-150-5p、SOCS1 mRNA 的診斷意義，其表達(dá)水平與中醫(yī)證型的相關(guān)性分析采用無序多分類Logistic分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

57例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組與19例健康對照組受試者，在性別、血常規(guī)、肝腎功能等方面，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），具有可比性。健康對照組患者類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，其病程為111.33 ± 18.72（月）。RA 入組時用藥方面：服用糖皮質(zhì)激素者6例（10.53%），非甾體類抗炎藥28 例（49.12%），甲氨蝶呤33 例（57.89%），來氟米特19例（33.33%），雷公藤多甙10 例（17.54%），中藥湯劑6例（10.53%）。 合 并 癥 方 面，合 并 高 血 壓8 例（14.04%），冠狀動脈粥樣硬化性心臟病2 例（3.50%），慢性淺表性胃炎2例（3.50%）。（見表1）

2.2 miR-150-5p在RA 患者、健康人外周血的相對表達(dá)水平

相對于健康對照組，RA 患者的miR-150-5p 的相對表達(dá)水平明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t = -19.019，P ＜0.05）。進(jìn)一步將RA 患者組，劃分為穩(wěn)定組和活動組，經(jīng)One-way ANOVA 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，兩組患者的miR-150-5p 的相對表達(dá)水平明顯下降（F=149.298，P ＜0.05）?；顒咏M比穩(wěn)定組相比，有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（見表2）

表2 兩組受試者miR-150-5p的相對表達(dá)水平

表3 兩組受試者SOCS1 mRNA的相對表達(dá)水平（±s）

表3 兩組受試者SOCS1 mRNA的相對表達(dá)水平（±s）

注：RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；HC：健康對照；穩(wěn)定組定義：RA 患者DAS28-ESR < 3.2；活動組定義：RA 患者DAS28-ESR ≥3.2。#，與健康對照組相比，P<0.05。

SOCS1 mRNA 9.18±0.38 18.12±1.57#14.36±2.13#18.65±1.00#分組HC組（n=19）RA組（n=57）穩(wěn)定組（n=7）活動組（n=50）

表4 RA的中醫(yī)證型分布

表5 中醫(yī)證型與miR-150-5p相對表達(dá)量的Logistic回歸分析（陽性結(jié)果）

圖1 雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果

2.3 SOCS1 mRNA在RA及健康對照組的表達(dá)水平

相對于健康對照組，RA 患者的SOCS1 mRNA 的相對表達(dá)水平明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t = 5.333，P ＜0.05）。進(jìn)一步將RA 患者組，劃分為穩(wěn)定組和活動組，經(jīng)One-way ANOVA 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，兩組患者的SOCS1 mRNA 的相對表達(dá)水平明顯升高（F=6.421，P ＜0.05）?；顒咏M比穩(wěn)定組相比，有升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（見表3）

2.4 miR-150-5p 降低了SOCS1 mRNA 3′-UTR 的穩(wěn)定性

SOCS1 mRNA 的3′-UTR 序列的DNA 片段連接到雙熒光素酶載體的LUC2 基因的3′端，結(jié)合位點(diǎn)為GGGTTGGG。雙熒光素酶報(bào)告基因測定如下圖所示，與陰性對照mimics 組相比，miR-150 mimics 組的熒光素值明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（25.46 ± 1.00 vs 21.84±0.19,P<0.05）。說明miR-150 mimics 降低了連接SOCS1 的3′UTR 序列的熒光蛋白質(zhì)的mRNA 的水平，證明miR-150-5p與SOCS1靶向結(jié)合。（見圖1）。

2.5 miR-150-5p、SOCS1 mRNA對RA的診斷預(yù)測分析

以miR-150 的相對表達(dá)水平為檢驗(yàn)變量構(gòu)建ROC 曲 線，并 計(jì) 算 曲 線 下 面 積AUC 為0.974（P ＜0.05）。根據(jù)Youden 指數(shù)，其最佳界值為3.06（敏感性0.981，特異性0.920）。（見圖2A）。

以SOCS1 mRNA 相對表達(dá)水平為檢驗(yàn)變量構(gòu)建ROC 曲 線，并 計(jì) 算 曲 線 下 面 積AUC 為0.425（P ＞0.05）。故SOCS1 mRNA對RA的診斷無指導(dǎo)意義。（見圖2B）。

2.6 miR-150-5p與RA中醫(yī)證型的相關(guān)性分析

頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，本研究中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中風(fēng)濕痹阻證（38.6%）、寒濕痹阻證（28.1%）、痰瘀痹阻證（14.0%）是常見證型。以miR-150-5p > 3.06，賦值0，miR-150-5p ≤3.06，賦 值1，經(jīng) 無 序 多 分 類Logistic 回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-150-5p ≤3.06 人群，其患風(fēng)濕痹阻證及寒濕痹阻證的風(fēng)險(xiǎn)分別為8.33 倍和250.00倍。（見表4、表5）

3 討論

圖2 miR-150-5p、SOCS1 mRNA相對表達(dá)量的ROC曲線

miRNA 主要通過與目標(biāo)mRNA 的3′端相結(jié)合，在翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)。本研究通過雙熒光素酶法證明miR-150-5p 與SOCS1 mRNA 有靶向結(jié)合關(guān)系。再者，本研究測定外周全血miR-150-5p 和SOCS1 mRNA 的相對表達(dá)水平。相對于健康人群，miR-150-5p表達(dá)水平更低。Niimoto T 等[12]研究報(bào)道，相對于骨性關(guān)節(jié)炎患者，RA 患者外周血產(chǎn)IL-17 T 細(xì)胞中，miR-150-5p 顯著高表達(dá)，與本研究結(jié)果似不一致。另有Honda N 等[13]報(bào)道，在系統(tǒng)性硬化癥患者中，miR-150在外周血中低表達(dá)，與本研究結(jié)果似乎一致?？梢钥闯觯壳暗难芯拷Y(jié)果報(bào)道各不一致，符合目前miRNAs 在RA 中的表達(dá)多樣性的特點(diǎn)[14]。究其原因：①可能與miR-150 的標(biāo)本來源不同有關(guān)，因?yàn)橥籱iRNA 在不同組織或細(xì)胞中的表達(dá)可不同，甚至同一miRNA 在同一組織或細(xì)胞中，因檢測方法不同，其結(jié)果也有不同；②可能與研究對照不同有關(guān)。Niimoto T等進(jìn)行的研究，其對照人群是骨性關(guān)節(jié)炎而非健康人群，導(dǎo)致對照標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，因而結(jié)果可能無可比性。本研究同時發(fā)現(xiàn)，相對于健康人群，RA 患者的SOCS1mRNA 表達(dá)水平更高，與既往研究結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了SOCS1 mRNA 在RA 中過表達(dá)的結(jié)論[15-17]。其原因可能為：①RA 患者TNF-a、IL-6、INF-γ 等促炎細(xì)胞因子可以激活JAK-STAT 通路，進(jìn)而可導(dǎo)致SOCS1 表達(dá)的上調(diào)[18]；②從miR-150-5p 與SOCS1 相互作用的角度，本研究中SOCS1 水平升高的原因，可以用miR-150-5p水平下降來部分解釋。

RA 的西醫(yī)治療，雖取得了充足的進(jìn)步，仍有患者因?yàn)樵\斷的延誤而導(dǎo)致疾病的不可逆性損害。而早期診斷本病，除了依靠類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體等生物標(biāo)志物，仍需不斷發(fā)現(xiàn)新的指標(biāo)，以更早的發(fā)現(xiàn)RA 患者，達(dá)到早期治療，延緩病變進(jìn)展的目的。通過AUC曲線，本研究發(fā)現(xiàn)miR-150-5p區(qū)分RA的敏感性和特異性分別達(dá)到了98.1%、92.0%，說明miR-150-5p 是RA 診斷的有效潛在生物標(biāo)志物。遺憾的是，本研究發(fā)現(xiàn)未能發(fā)現(xiàn)SOCS1 mRNA 對RA 診斷的指導(dǎo)意義。

既往類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中醫(yī)癥候研究，大多停留在橫斷面調(diào)查分析層面，缺乏客觀化指標(biāo)的確證[19-21]。作為中醫(yī)的“證”有即時性與差異性的特點(diǎn)，因?yàn)槠涫悄骋浑A段的情況，所以會處于不斷的動態(tài)變化之中。而miRNAs 及其表達(dá)的動態(tài)變化過程與臨床表現(xiàn)的癥狀和體征有內(nèi)在的聯(lián)系，具有精確特異的時空表達(dá)特點(diǎn)，因此，其可能參與了證候的發(fā)生與動態(tài)變化[22]。因此，近年來，作為表觀遺傳學(xué)證據(jù)之一的microRNAs，在RA 的中醫(yī)證型相關(guān)研究中的重要性，逐步受到重視。本研究發(fā)現(xiàn)RA 患者的miRNA-150-5p 的相對表達(dá)水平，低于正常人群。miR-150-5p 其界值為3.06，其診斷為風(fēng)濕痹阻證、寒濕痹阻證的相對危險(xiǎn)度分別達(dá)到8.33、250.00，說明其是診斷風(fēng)濕痹阻證、寒濕痹阻證等證型的有效指標(biāo)。再者，本研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)濕痹阻證、寒濕痹阻證是RA 的主要證型，而不是既往研究所列的濕熱痹阻證[19-21]?；颊咂剿伢w虛，陽氣不足，衛(wèi)外不固，腠理空虛，易為風(fēng)、寒、濕、熱之邪乘虛侵襲，痹阻筋脈、肌肉、骨節(jié)，而致營衛(wèi)行澀，經(jīng)絡(luò)不通，發(fā)為本病。陽氣虛衰，寒氣內(nèi)生，復(fù)感風(fēng)寒濕邪，從陰化寒，而成為風(fēng)寒濕痹[23]。因此，從病因病機(jī)來看，風(fēng)濕痹阻證、寒濕痹阻證均可能是RA 的主要癥候。考慮到本研究的樣本量較小，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以驗(yàn)證本研究結(jié)果。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p、SOCS1 mRNA 在RA 患者中的相對表達(dá)水平有差異性表達(dá)，且miR-150-5p 靶向結(jié)合于SOCS1 mRNA。miR-150-5p 可能作為RA 疾病診斷、中醫(yī)證型判斷的有力指標(biāo)，可為“病”“證”結(jié)合的診斷提供參考。本研究存在一定的不足，即樣本量較小，可能存在一定的偏倚。因此，需謹(jǐn)慎解讀本研究結(jié)果。下一步，需結(jié)合基因芯片技術(shù)，擴(kuò)大樣本量，發(fā)現(xiàn)更多特異性miRNAs，從而為RA的疾病診斷及中醫(yī)證型判斷提供更多更確切的客觀證據(jù)。