黃 敏，陳會(huì)敏，周艷艷，徐安莉，陳龍?jiān)?，趙 敏

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 武漢 430065）

中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，脾為后天之本，生化之源，以滋養(yǎng)育胎?；跈C(jī)體的免疫調(diào)控機(jī)制來探討腎虛型胎漏、胎動(dòng)欲墜等癥具有重要的臨床意義，這也是目前中醫(yī)臨床上的研究熱點(diǎn)[1-3]。

本課題組前期的研究表明，腎虛會(huì)影響Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達(dá)，進(jìn)而干擾機(jī)體的免疫水平[4]。TLR4 是一種跨膜蛋白受體，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分。胞外區(qū)參與細(xì)菌脂多糖、類脂A 和熱休克蛋白60等多種病原相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）的識(shí)別，激活先天性免疫反應(yīng)，引起細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而活化獲得性免疫反應(yīng)[5-6]?？梢?，TLR4 是連接天然免疫與特異性免疫的橋梁，是調(diào)控機(jī)體免疫的重要分子，具有重要的研究意義。

TLR 介導(dǎo)的免疫機(jī)制可分為MyD88 依賴性和MyD88 非依賴性兩種[7]。MyD88 是TLR 的接頭蛋白，有N 端死亡結(jié)構(gòu)域和C 端的TIR 結(jié)構(gòu)域（Toll/interleukin-1receptor（IL-1R）domain）。死亡結(jié)構(gòu)域作用于IL-1R相關(guān)激酶（IL-1R-associated kinase，IRAK），引起IRAK 的自磷酸化。磷酸化的IRAK 進(jìn)而通過活化IκB (inhibitor-κB)來激活NF-κB[8-9]。NF-κB 由p50和p65 構(gòu)成，p50 負(fù)責(zé)結(jié)合DNA，p65 則結(jié)合抑制蛋白IκB。正常情況下，p65 與IκB 結(jié)合將NF-κB 限定于細(xì)胞漿中，阻止其入核。刺激條件下，IκB 磷酸化并降解，NF-κB被激活并入核結(jié)合特定DNA序列啟動(dòng)大量免疫介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，引起免疫應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。NF-κBp65在NF-κB 的激活和免疫因子的轉(zhuǎn)錄中起著重要的作用，國(guó)內(nèi)外都有很多相關(guān)的最新研究[10-13]。我們前期了解到腎虛與TLR4 相關(guān)，但是腎精虧虛能否進(jìn)一步作用于下游的MyD88和NF-κB仍需進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠90 只（雌∶雄=2∶1），8 周齡，體重200±20 g，許可證編號(hào)SCXK（鄂）2017-0012，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，大鼠自由飲水和采食，室溫22±2℃，光照明暗各12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 左歸丸混懸液的制備

左歸丸購(gòu)自上海雷允上封浜制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020371，每粒重0.1 g。根據(jù)大鼠與人的體表面積換算公式，計(jì)算出大鼠劑量為0.58 g/100 g·d-1。據(jù)此，將左歸丸配制成濃度為0.58 g·mL-1的混懸液，4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑

Trizol 由Aidlab 公 司 提 供，貨 號(hào) 為252250AX；SYBR Green Master Mix，由Vazyme 公司提供，貨號(hào)為Q111-02；大鼠甲狀腺素（T3 和T4）診斷試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，貨號(hào)為F16839 和F16840；小鼠單抗β-Actin 由武漢博士德生物工程有限公司提供，貨號(hào)為BM0627；兔多抗NF-κBp65 由Abcam公司提供，貨號(hào)Ab16502；兔多抗MyD88由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司提供，貨號(hào)為23230-1-AP；兔多抗TLR4，由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司提供，貨號(hào)為19811-1-AP；HRP 標(biāo)記羊抗小鼠二抗，由武漢博士德生物工程有限公司提供，貨號(hào)為BA1051；HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗，由武漢博士德生物工程有限公司提供，貨號(hào)為BA1054。

1.4 主要儀器

模擬地震振動(dòng)臺(tái)（上海鼎盛機(jī)械制造廠），型號(hào)AB22001；組織攤烤片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），型號(hào)JK-6；顯微鏡（Olympus），型號(hào)BX53；病理切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），型號(hào)RM 2016；電鏡（FEI 公司），型號(hào)TecnaiG2 20TWIN；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI 公司），型號(hào)QuantStudio 6。

1.5 動(dòng)物分組、腎精虧虛孕鼠模型建立及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按照比例（雌∶雄=2∶1）進(jìn)行合籠配對(duì)。母鼠受孕后，按隨機(jī)取數(shù)法分為正常組、模型組和補(bǔ)腎組，每組20 只。自懷孕第1 天起（受孕第一天定義為顯微鏡下看到陰栓的當(dāng)天），模型組和補(bǔ)腎組每日采用梅花針叩擊孕鼠頭部和仿地震平臺(tái)震動(dòng)及包天桐的懸吊應(yīng)激法三種因素復(fù)合造模，直至其分娩。

梅花針叩擊孕鼠頭部造模法：頻率20 次/min，每次5 min，隔天一次，不定時(shí)。

仿地震平臺(tái)震動(dòng)造模法：每天不定時(shí)振動(dòng)1 次(頻率：垂直振動(dòng)3 次，水平振動(dòng)3 次)，每次持續(xù)5 min，每次單只放入仿地震平臺(tái)造模。

包天桐的懸吊應(yīng)激造模法：用膠布將孕鼠尾部距肛門1.5 ～2 cm 處固定在長(zhǎng)木條上，在其正下方放置一缸水，水面恰及孕鼠鼠鼻，模擬時(shí)刻處于將溺水的危險(xiǎn)狀態(tài)，促使孕鼠有恐懼感。

哺乳期仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉癥狀，隨后排出黃白色粥樣稀便，臥地不起，強(qiáng)迫仔豬站立，仔豬行走時(shí)左右搖擺，行走不穩(wěn)，不能正常吃乳，仔細(xì)觀察發(fā)病豬四肢內(nèi)側(cè)存在紫色點(diǎn)狀出血，發(fā)病豬腹瀉物中夾雜不完全的白色凝乳塊。隨著病情進(jìn)一步發(fā)展，腹瀉癥狀嚴(yán)重，患病豬身體逐漸消瘦，不能正常行走，行走時(shí)左右搖晃，共濟(jì)失調(diào)，四肢叉開，口吐白沫，叫聲嘶啞，耳部和腹部皮膚表面發(fā)紅，并出現(xiàn)綠豆大小的藍(lán)紫色出血點(diǎn)。多數(shù)患病豬在發(fā)病中后期，排出黃色或黃褐色粥樣稀便，病豬在臨死前表現(xiàn)角弓反張，全身肌肉震顫，出現(xiàn)間歇性痙攣，后期肢體麻痹，呈現(xiàn)犬坐姿勢(shì)，有時(shí)在圈舍中轉(zhuǎn)圈或者側(cè)臥時(shí)四肢劃動(dòng)呈游泳狀，最后因機(jī)體衰竭而死。

補(bǔ)腎組自妊娠第一天起，予左歸丸混懸液灌胃，灌胃劑量為1 ml/100 g·d-1，直至孕鼠分娩。正常組和模型組孕鼠自妊娠第一天起每日予生理鹽水灌胃，灌胃劑量為1 ml/100 g·d-1，直至孕鼠分娩。

1.6 動(dòng)物一般狀態(tài)觀測(cè)

實(shí)驗(yàn)過程中，每日觀察各組孕鼠的神態(tài)、活動(dòng)量、進(jìn)食量、二便的排瀉、被毛的生長(zhǎng)榮枯、是否有先兆流產(chǎn)以及孕鼠胎產(chǎn)數(shù)。

1.7 檢測(cè)孕鼠血清T3和T4含量

孕鼠產(chǎn)仔后，立刻取血。孕鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 ml·kg-1）麻醉，剪開腹壁，分離并剪斷腹主動(dòng)脈，取血5 ml 左右，靜置30 分鐘，離心（4℃、3000 r·min-1、15 min），分離血清，用大鼠甲狀腺素（T3 和T4）診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 脾臟顯微結(jié)構(gòu)檢測(cè)

孕鼠分娩當(dāng)天放血處死孕鼠，取脾臟組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，常規(guī)切片備用。HE 染色后用光學(xué)顯微鏡觀察脾臟顯微結(jié)構(gòu)改變。

1.9 脾臟超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)

取孕鼠脾臟組織切碎至1 mm3大小，用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，經(jīng)4%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定1 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片至4μm，鈾鉛雙重染色后，電鏡觀察脾臟超微結(jié)構(gòu)改變。

1.10 RT-PCR檢測(cè)TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平

取孕鼠脾臟組織，采用Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，并用RT-PCR 法測(cè)定上述三種mRNA的表達(dá)水平，引物參見表1。逆轉(zhuǎn)錄體系：5μg RNA、2μl Oligo(dT)18(10 μM)、4 μl dNTP (2.5 mM)、4 μl 5× Hiscript Buffer、1μl Hiscript Reverse Transcriptase、0.5μl Ribonuclease Inhibitor，補(bǔ)ddH2O（Rnase free）至體積為20 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃5min，50℃15min，85℃5min，4℃10min。RT-PCR 體系：4 μl cDNA（8×稀釋）、0.4 μl 上游引物、0.4 μl 下游引物、10 μl SYBR Green Master Mix、0.4μl 50×ROX Reference Dye 2、4.8μl H2O。RTPCR 條件：50°C 2 min，95°C 10 min；40 個(gè)循環(huán)條件：95°C 30 sec，60°C 30 sec。數(shù)據(jù)以2-ΔΔct法分析。

1.11 Western blotting檢測(cè)TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平

取孕鼠脾臟組織，提取總蛋白質(zhì)，并測(cè)定濃度。每組取50 μg 總蛋白先后進(jìn)行兩次SDS-PAGE 電泳：5%濃度，100 V，20 min；10%濃度，130 V，60 min。然后，60 V 3.5 h電轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。用封閉液將PVDF膜（1×TBST，5%脫脂奶粉）室溫振搖封閉0.5 h。加入對(duì)應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，1 × TBST 液洗膜3 次。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，并洗膜。加ECL 發(fā)光劑，顯影、定影，膠片洗滌，干燥后觀察并記錄。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 22.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較進(jìn)行t 檢驗(yàn)，多組均數(shù)間兩兩比較采用方差分析，P<0.05 為組間有差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠一般情況及血清T3、T4的比較

如表2所示，正常組孕鼠活動(dòng)度好，采食量與飲水量正常，產(chǎn)仔正常。與正常組孕鼠比較，模型組孕鼠出現(xiàn)體毛脫落枯疏且無光澤、易驚恐、拱背蜷縮、喜聚集扎堆、采食量與飲水量減少和大便軟稀等癥狀，結(jié)合中醫(yī)辯證和恐傷腎的病因病機(jī)，說明模型組孕鼠存在腎精虧虛癥。同時(shí)，模型組胎產(chǎn)數(shù)量明顯降低，仔鼠活動(dòng)度較差，且有2 只孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)，有2 只孕鼠出現(xiàn)早產(chǎn)，并娩出少量死胎，表明復(fù)合應(yīng)激法所致的腎精虧虛會(huì)導(dǎo)致孕鼠的生殖能力下降。此外，模型組孕鼠血清甲狀腺激素（T3和T4）的水平明顯低于對(duì)照組，提示模型組孕鼠甲狀腺機(jī)能減退，基礎(chǔ)代謝降低，進(jìn)一步證實(shí)模型組孕鼠存在腎精虧虛（表2）。與模型組孕鼠比較，補(bǔ)腎組孕鼠較平靜，無明顯驚恐和流產(chǎn)現(xiàn)象，其胎產(chǎn)數(shù)量和仔鼠活動(dòng)度尚可，可見少量無尾畸胎。同時(shí)，補(bǔ)腎組血清甲狀腺激素（T3和T4）的水平明顯回升，這表明補(bǔ)腎填精方左歸丸可以改善腎精虧虛孕鼠的生存狀態(tài)、生殖功能和基礎(chǔ)代謝水平。

表1 引物序列表

表2 孕鼠一般情況及血清T3、T4的比較

2.2 孕鼠脾臟組織顯微結(jié)構(gòu)的比較

結(jié)果如圖1所示，正常組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)致密，淋巴小結(jié)邊界清晰，紅髓、白髓結(jié)構(gòu)完整，淋巴細(xì)胞排列致密整齊，細(xì)胞未見明顯的分裂分化現(xiàn)象（圖1A-1C）。與正常組孕鼠比較，模型組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)稀疏，脾小梁增寬，較多的淋巴小結(jié)面積縮小且界限模糊，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量大量減少且排列稀疏分散，并出現(xiàn)部分壞死的淋巴細(xì)胞（圖1D-1F），表明復(fù)合應(yīng)激法所致的腎經(jīng)虧虛會(huì)導(dǎo)致孕鼠脾臟組織的顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。與模型組孕鼠比較，補(bǔ)腎組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)稍稀疏、白髓結(jié)構(gòu)輕度改變，淋巴小結(jié)界限較清晰，淋巴細(xì)胞的數(shù)量有恢復(fù)（圖1G-1I），表明補(bǔ)腎填精方左歸丸可以使模型組孕鼠的脾臟顯微結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)正常。

圖1 孕鼠脾臟組織顯微結(jié)構(gòu)的比較（HE染色×100，×200，×400）

2.3 孕鼠脾臟組織超微結(jié)構(gòu)的比較

結(jié)果如圖2 所示，正常組孕鼠脾臟內(nèi)未見明顯的細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象（圖2A）；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核核膜平滑，核內(nèi)染色質(zhì)較濃，且核膜附近的染色質(zhì)較多（圖2B）；同時(shí)，胞漿中各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，線粒體內(nèi)可見清晰的嵴狀結(jié)構(gòu)（圖2C）。與正常組孕鼠比較，模型組孕鼠脾臟內(nèi)有明顯的細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象（圖2D）；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核核膜不規(guī)則，部分核膜有明顯的凹凸不平現(xiàn)象，核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度的固縮（圖2E）；同時(shí)，胞漿中部分細(xì)胞器崩解，有的線粒體出現(xiàn)水腫和嵴狀結(jié)構(gòu)受損（圖2F）；表明復(fù)合應(yīng)激法所致的腎精虧虛會(huì)導(dǎo)致孕鼠脾臟組織的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。與模型組孕鼠比較，補(bǔ)腎組孕鼠脾臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象明顯減少（圖2G）；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核核膜不規(guī)則和染色質(zhì)固縮現(xiàn)象減輕（圖2H）；胞漿中的細(xì)胞器和線粒體形態(tài)明顯恢復(fù)（圖2I）；表明表明補(bǔ)腎填精方左歸丸可以使模型組孕鼠的脾臟超微結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)正常。

2.4 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平的比較

結(jié)果如圖3所示，與正常組比較，模型組孕鼠脾臟中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（ΔP < 0.01），表明復(fù)合應(yīng)激法所致的腎精虧虛會(huì)導(dǎo)致孕鼠脾臟中的TLR4 免疫通路相關(guān)基因的mRNA水平受到抑制。與模型組比較，補(bǔ)腎組孕鼠脾臟中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表達(dá)水平明顯回升（▲P<0.01），表明補(bǔ)腎填精方左歸丸能夠上調(diào)TLR4免疫通路中相關(guān)基因的mRNA水平。

圖2 孕鼠脾臟組織超微結(jié)構(gòu)的比較（電鏡×1700，×5000，×11500）

圖3 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平的比較

圖4 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的比較

2.5 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的比較

結(jié)果如圖4所示，與正常組比較，模型組脾臟組織中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（ΔP <0.01），表明復(fù)合應(yīng)激法所致的腎精虧虛會(huì)導(dǎo)致孕鼠脾臟中的TLR4 免疫通路相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)受到抑制。與模型組比較，補(bǔ)腎組孕鼠脾臟中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯回升（▲P<0.01，＃P<0.05），表明補(bǔ)腎填精方左歸丸能夠上調(diào)TLR4免疫通路中相關(guān)基因的蛋白質(zhì)水平。

3 總結(jié)與討論

恐是中醫(yī)五志之一，長(zhǎng)時(shí)間的過度恐懼會(huì)有損機(jī)體健康[14]。《素問·陰陽應(yīng)象大論》中提出了“恐傷腎”理論。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)該理論采用復(fù)合應(yīng)激法復(fù)制出腎精虧虛“恐傷孕鼠”模型[15-16]。中醫(yī)的“腎”本質(zhì)上包括了下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺體的功能。目前，腎虛證動(dòng)物模型的判斷依據(jù)主要是其是否有類似于人的腎虛證臨床表現(xiàn)以及其甲狀腺、腎上腺、生殖能力和免疫水平是否出現(xiàn)紊亂[17]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組孕鼠出現(xiàn)了喜歡扎堆、蜷縮拱背、口唇蒼白、雙眼無神、食欲減退、大便質(zhì)地較稀和皮毛枯疏無華等癥狀，也出現(xiàn)了流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎產(chǎn)數(shù)量明顯減少、產(chǎn)下死胎和甲狀腺激素（T3和T4）的水平降低等現(xiàn)象，結(jié)合中醫(yī)辯證和恐傷腎的病因病機(jī)，說明本實(shí)驗(yàn)的腎精虧虛模型是成功的。左歸丸是具有補(bǔ)腎填精作用的經(jīng)典方劑[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，左歸丸干預(yù)的補(bǔ)腎組孕鼠的生存狀態(tài)、生殖功能和甲狀腺激素水平都得到了顯著改善，這與文獻(xiàn)報(bào)道的左歸丸能提高生殖能力和調(diào)節(jié)腎精虧虛癥狀的結(jié)論一致[20-22]。

機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱與中醫(yī)理論中的“衛(wèi)氣”密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，衛(wèi)氣源于下焦腎氣，生于中焦脾胃所化生的后天之氣，最后借助于肺的宣發(fā)和肅降功能布于全身肌表，發(fā)揮其抗御之能。故此，免疫功能與機(jī)體的肺、脾、腎有關(guān)。腎精虧虛已被證實(shí)能影響機(jī)體的免疫功能[21-22]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以孕鼠的免疫器官—脾臟為靶標(biāo)，探究“恐傷腎”對(duì)其免疫水平的影響。結(jié)果表明，模型組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)稀疏，脾小梁增寬，較多的淋巴小結(jié)面積縮小且界限模糊，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量大量減少且排列稀疏分散，并出現(xiàn)部分壞死的淋巴細(xì)胞。電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)模型組孕鼠脾臟內(nèi)有細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核核膜不規(guī)則，部分核膜有明顯的凹凸不平現(xiàn)象，核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度的固縮；同時(shí)，胞漿中部分細(xì)胞器崩解，有的線粒體出現(xiàn)水腫和嵴狀結(jié)構(gòu)受損。這些形態(tài)學(xué)的改變都提示“恐傷腎”模型組孕鼠的脾臟組織出現(xiàn)了異常，而這種結(jié)構(gòu)異?？赡苁悄Ｐ徒M孕鼠免疫功能受損的原因之一。左歸丸干預(yù)的補(bǔ)腎組孕鼠的脾臟結(jié)構(gòu)稍稀疏、白髓結(jié)構(gòu)輕度改變，淋巴小結(jié)界限較清晰，淋巴細(xì)胞的數(shù)量有所恢復(fù)；同時(shí)，脾臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象明顯降低，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核核膜不規(guī)則和染色質(zhì)固縮現(xiàn)象減輕，胞漿中的細(xì)胞器和線粒體形態(tài)明顯恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，左歸丸能有效改善腎精虧虛孕鼠脾臟的結(jié)構(gòu)，這與已有的左歸丸能改善免疫功能的結(jié)論具有一致性[21-22]。但是，本實(shí)驗(yàn)選用脾臟為靶標(biāo)，來探究“恐傷腎”及左歸丸干預(yù)對(duì)其的影響，能更進(jìn)一步論證腎精虧虛與補(bǔ)腎填精與機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)系。

本課題組前期的研究表明，腎虛會(huì)影響TLR4 的表達(dá)[4]。TLR 可以識(shí)別外源的病原體和內(nèi)源性物質(zhì)及降解物，是連接天然免疫與特異性免疫的主要橋梁[5-6]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠脾臟中TLR4 蛋白和基因的表達(dá)明顯減少，推測(cè)TLR 通路及下游中的相關(guān)因子會(huì)受到影響。TLR4 主要是通過觸發(fā)MyD88 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而激活NF-κB 并啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。NF-κB由p50和p65構(gòu)成，通常p65與抑制蛋白IκB 結(jié)合將NF-κB 限定于細(xì)胞漿中。刺激條件下，外源性或/和內(nèi)源性配體與TLR4 結(jié)合并呈遞給胞內(nèi)MyD88，隨后通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)磷酸化并降解IκB，NF-κB與IκB解離并活化入細(xì)胞核啟動(dòng)并調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[10-11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎精虧虛模型組孕鼠脾臟內(nèi)的MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平都明顯下調(diào)，這表明腎精虧虛會(huì)降低孕鼠脾臟中的TLR4 的表達(dá)，并通過MyD88 的傳導(dǎo)作用于靶標(biāo)因子NF-κBp65。補(bǔ)腎填精方左歸丸干預(yù)能顯著地逆轉(zhuǎn)模型孕鼠脾臟內(nèi)上述三種因子的下降，說明左歸丸能借助于激活TLR4/MyD88/NF-κBp65 通路來調(diào)控腎精虧虛引發(fā)的模型孕鼠免疫功能紊亂。臨床上已有研究開始探討腎虛與TLR4 及其下游免疫通路的關(guān)系。譚從娥等[23]發(fā)現(xiàn)右歸丸干預(yù)可以下調(diào)腎陽虛患者外周血中的TLR4 的表達(dá)而上調(diào)My D88 及NF-κB 的表達(dá)。這與本研究中左歸丸干預(yù)腎精虧虛大鼠脾臟中的TLR4 的變化趨勢(shì)相反，但是與My D88 及NF-κB 的變化趨勢(shì)一致。張揚(yáng)等[24]發(fā)現(xiàn)溫腎方可提高腎陽虛型高丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平慢性乙型肝炎患者的外周血中的TLR4 活性以發(fā)揮其抗病毒療效。這與本研究中左歸丸干預(yù)腎精虧虛大鼠脾臟中的TLR4 的變化趨勢(shì)一致?？梢?，近幾年，TLR4/Myd88/NF-κB 通路在探究腎虛與免疫的關(guān)系中引發(fā)了較大的關(guān)注，但其具體的分子機(jī)制仍不清楚。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎精虧虛孕鼠的脾臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，左歸丸干預(yù)可以有效改善這些變化，這能很好地補(bǔ)充已有的腎精虧虛相關(guān)的中醫(yī)藏象理論與實(shí)驗(yàn)研究工作。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步揭示腎精虧虛孕鼠脾臟中的TLR4、MyD88 和NF-κBp65 三種因子的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平都明顯下調(diào)，左歸丸干預(yù)可以有效逆轉(zhuǎn)該通路的下降趨勢(shì)，這說明該通路可能是補(bǔ)腎填精法治療腎精虧虛引發(fā)的免疫紊亂的靶標(biāo)通路，為中醫(yī)藥治療腎精虧虛相關(guān)的免疫功能缺陷病證的研究提供了一定的依據(jù)。同時(shí)，中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本,脾為后天之本,生化之源,以滋養(yǎng)育胎。本實(shí)驗(yàn)中的左歸丸干預(yù)不僅能有效改善孕鼠脾臟的結(jié)構(gòu)變化和TLR4/MyD88/NF-κBp65 免疫通路的變化也能顯著地提高孕鼠的生育能力，這進(jìn)一步證實(shí)了基于機(jī)體的免疫調(diào)控機(jī)制來探討腎虛型胎漏、胎動(dòng)欲墜等癥具有重要的臨床意義。