關(guān)遠凱 陳 說

（1.東莞市公安局塘廈分局刑警大隊，廣東 東莞523710；2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州511436）

真核細胞基因組僅有約2%為可編碼蛋白質(zhì)的信使RNA（mRNA），而75%-90%的RNA是非編碼 RNA （ncRNA）［1］。近年來，隨著RNA測序（RNA-seq）的應(yīng)用和發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種新型的內(nèi)源性非編碼RNA：環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNAs）。circRNA結(jié)構(gòu)上高度保守且共價閉合，最早被Kolakofsky以及Sanger等人發(fā)現(xiàn)于類病毒顆粒，隨后逐漸在動物細胞以及真核酵母中得到驗證。2012年Salzman等人對circRNA進行了全面和系統(tǒng)報告，越來越多的環(huán)狀RNA逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)，特別是其作為“miRNA海綿”在基因表達調(diào)控中發(fā)揮的作用，已成為新的研究熱點。

circRNA廣泛存在于外周血中，不易被RNA酶降解，穩(wěn)定性高，因而有助于推斷窒息死亡后陳舊血跡及尸體的時間。本綜述對circRNA的特征，其形成和功能，以及缺氧相關(guān)環(huán)狀RNA在窒息死亡原因推斷中的意義進行闡述。

1 CircRNA的結(jié)構(gòu)特點

circRNAs長度約為幾百至幾千個核苷酸，其獨特的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其缺乏5’末端帽子、3’末端多聚腺苷酸（polyA）尾。

circRNA具有以下重要特征：（1）閉環(huán)結(jié)構(gòu)：因此耐受核酸外切酶，相比于同源線性RNA，穩(wěn)定性更高；（2）在體內(nèi)廣泛表達，表達水平具有組織特異性，與其同源線性RNA的表達水平無相關(guān)性，有時甚至是其同源線性RNA的10倍以上；（3）多數(shù)circRNA具有高度保守的序列；（4）大多數(shù)circRNA位于細胞質(zhì)中，而少量內(nèi)含子衍生的circRNA位于細胞核中［2］；（5） 大多數(shù)circRNA包含外顯子序列，而其中少數(shù)是通過內(nèi)含子環(huán)化形成的［6］；（6）一些circRNA富含來自外顯子的miRNA應(yīng)答元件（MRE）；（7）circRNA在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。

2 CircRNA的形成機制

環(huán)狀RNA來源于其親本基因的轉(zhuǎn)錄，由前體mRNA通過非經(jīng)典的選擇性剪接產(chǎn)生，根據(jù)其來源分為以下三類。

2.1 外顯子來源的circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）

超過80%的circRNA是ecircRNA,Jeck等人通過系列研究確定了兩種ecircRNA模型：（1）套索驅(qū)動的環(huán)化（Lariat-driven circularization）；（2）內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化（Intron-nairingdriven circularization）。Wilusz和 Sharp證明，circRNA分子主要通過反向剪接產(chǎn)生。

2.2 內(nèi)含子環(huán)狀RNA（circular intronic RNA，ciRNA）

ciRNA是指內(nèi)含子獨立環(huán)化形成環(huán)狀內(nèi)含子RNA，其主要存在于某些組織的細胞核中，多位于5’剪切位點與3’分支點附近，富含GU序列與富含C序列的共價模體誘導(dǎo)合成，內(nèi)含子環(huán)化后再經(jīng)過剪除尾端及分支點序列，形成內(nèi)含子環(huán)狀結(jié)構(gòu)；此外，RNA結(jié)合蛋白（RBPs）可以誘導(dǎo)剪接受體與供體直接連接，再經(jīng)過內(nèi)含子剪切，形成完整的外顯子環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

2.3 外顯子-內(nèi)含子circRNA（ElciRNA）側(cè)翼內(nèi)含子序列包含的在內(nèi)含子環(huán)化

Salzman等人發(fā)現(xiàn)ElciRNA由外顯子和內(nèi)含子共同組成。外顯子環(huán)化主要依賴外顯子側(cè)翼的長內(nèi)含子序列，而側(cè)翼內(nèi)含子序列包含的反向序列（如ALU）在內(nèi)含子環(huán)化時起重要作用。通常情況下，圍繞外顯子的內(nèi)含子被拼接出來；而在某些情況下，它們被保留，并被命名為保留內(nèi)含子的circRNA或ElciRNA［3］。

3 CircRNA的生物學(xué)功能

3.1 miRNA海綿作用

環(huán)狀RNA通過其含有的miRNA應(yīng)答元件（MRE，microRNA response element） 競爭性結(jié)合miRNA，解除miRNA對下游靶基因的抑制，發(fā)揮“miRNA海綿”的作用，從而參與競爭性內(nèi)源 RNA （ceRNA,competeing endogenous RNA）網(wǎng)絡(luò)。目前研究最多的是CDR1-as，具有70余個保守的miR-7結(jié)合位點。Xu等人研究表明CDR1-as能夠結(jié)合miR-7與AGO2蛋白形成的RISC，解除miR-7對靶基因的抑制，從而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)通路中發(fā)揮重要作用。

3.2 調(diào)控RNA結(jié)合蛋白

circRNA可通過與蛋白質(zhì)結(jié)合抑制其活性、募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控蛋白質(zhì)的活性，為蛋白質(zhì)與RNA，DNA以及蛋白質(zhì)之間的相互作用提供平臺。例如：circ-Foxo3通過結(jié)合細胞周期素依賴激酶2（CDK2）以及CDKs抑制劑P21形成circ-Foxo3/p21/CDK2三元復(fù)合體，促進細胞周期阻滯。

3.3 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

circRNA可以定位于轉(zhuǎn)錄起始位點附近，結(jié)合RNA聚合酶II復(fù)合體，影響轉(zhuǎn)錄，從而對其源基因發(fā)揮順式調(diào)控作用或者反式調(diào)節(jié)作用。Ashwal-Fluss等人研究發(fā)現(xiàn)剪接因子MBL的第二個外顯子可以環(huán)化形成circRNA，其與前體mRNA的線性剪接競爭并影響線性RNA的形成以調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達［4］。

3.4 參與蛋白質(zhì)翻譯

研究表明，circRNA除了可以在RNA水平發(fā)揮功能，也可以像線性mRNA一樣翻譯形成蛋白質(zhì)。Legnini等人研究發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609含有相同于線性轉(zhuǎn)錄本的開放閱讀框，從起始密碼子開始終止于環(huán)化形成的框內(nèi)終止密碼子［5］。Yang等人發(fā)現(xiàn)N6-甲基腺苷（m6A）通過RNA堿基修飾，促進了circRNA蛋白質(zhì)翻譯功能的有效啟動。最近，研究發(fā)現(xiàn)circRNA在人骨肉瘤細胞中具有蛋白翻譯功能，但其翻譯效率明顯低于線性RNA。

4 CircRNA在缺氧窒息中的研究進展

人體呼吸過程由外呼吸、血液中氣體運輸和內(nèi)呼吸三個階段共同構(gòu)成。三者中任一階段受阻或異常，均可導(dǎo)致全身各組織器官缺氧，呼吸障礙、氧氣不足、二氧化碳滯留，進而引起相應(yīng)細胞代謝障礙、功能紊亂和形態(tài)結(jié)構(gòu)損害，整個過程稱為窒息（asphyxia），因窒息而導(dǎo)致的死亡稱為窒息死（asphyxial death）。

在法醫(yī)學(xué)實踐中通常根據(jù)顏面部淤血發(fā)紺腫脹、瘀點性出血、尸斑出現(xiàn)的時間分布、尸冷進展速度、牙齒浸染等尸表征象，結(jié)合內(nèi)部器官淤血、器官被膜下瘀點性出血、肺氣腫水腫等尸體內(nèi)部征象，判斷尸體死因是否為缺氧窒息死亡。當尸體腐敗、現(xiàn)場被破壞、尸體檢驗中未發(fā)現(xiàn)明顯陽性體征時，往往難以確定死亡原因。法醫(yī)學(xué)鑒定受血液成分復(fù)雜性及死后環(huán)境因素等的影響，血液pH值變化、血氣分析及血液離子濃度改變等檢測方法存在不確定性。近年來，研究者試圖通過分子生物學(xué)手段建立缺氧窒息相關(guān)動物模型，檢測HIF相關(guān)基因的蛋白和mRNA表達水平變化，篩選窒息死亡相關(guān)的輔助診斷指標。但由于尸體樣本死亡時間不等，蛋白質(zhì)、mRNA等分子發(fā)生不同程度的降解，因而死亡原因推測具有一定局限性。circRNA廣泛存在于外周血中，不容易被RNA酶降解，穩(wěn)定性高，因而對窒息死亡后陳舊血跡及陳舊尸體中的時間推斷可能具有重要意義。

4.1 缺氧對circRNA生物合成及活性的影響

Hsiao等人通過體內(nèi)體外實驗研究表明，缺氧應(yīng)激能促進circCCDC66積累，促進細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，并且由于自身的穩(wěn)定性能加強這種積累作用，提示circRNA可能在缺氧缺血所致?lián)p傷的病理過程中具有重要作用。

Boeckel等人研究表明缺氧條件下可以誘導(dǎo)circZNF292、circAFF1和circDENND4C的表達，下調(diào)內(nèi)皮細胞中cTHSD1表達，且缺氧條件下誘導(dǎo)的circZNF292在體外實驗中表現(xiàn)出促血管生成活性［6］。

4.2 circRNA在缺氧中的功能以及在窒息死亡原因推斷中的意義

Dang等人研究表明在缺氧條件下HUVEC細胞中circ_0010729表達上調(diào)，且可通過靶向調(diào)節(jié)miR-186/HIF-1α影響血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡。HIF（hypoxia-inducible factor，缺氧誘導(dǎo)因子）是一種受氧濃度調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子，在缺氧條件下可激活包括碳酸酐酶9（CA9，carbonic anhydrase 9）、葡萄糖轉(zhuǎn)運子1（GLUT1，glucose transporter 1）在內(nèi)的100多種缺氧反應(yīng)性基因表達［7］，參與窒息死亡的不同階段，具有作為窒息標志物的可能性。Liang等人研究表明circDENND4C在缺氧條件下含量增加，而HIF1α表達水平下調(diào)后又可導(dǎo)致circDENND4C含量減少，這表明circDENND4C是一種HIF1α相關(guān)的circRNA。因而當前針對circRNA與缺氧的相關(guān)研究，特別是與HIF的相互調(diào)控研究，可能為尋找窒息死亡原因特異性標志物提供依據(jù)。

5 展望

雖然多種死亡機制均可歸結(jié)為組織器官缺氧，但不同的死亡機制在不同臟器內(nèi)會存在缺氧程度的不同，頸部血液循環(huán)受阻造成的窒息往往腦組織先缺氧，而溺水死亡則是肺部首先缺氧。circRNA通過調(diào)控miRNA/HIF等途徑參與多種缺氧反應(yīng)過程，為從分子水平深入闡述缺氧窒息所引起的機體死亡機制提供了線索。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在缺氧時含量或活性發(fā)生改變的一系列 circRNA:cZNF292、cAFF1、cDENND4C、cTHSD1、circZNF292、circ_0010729以及circDENND4C，為窒息特異性標志物的篩選提供了理論依據(jù)。也將在未來進一步深入分析不同窒息方式中器官內(nèi)circRNA的定量差異，有助于對原因不明的窒息提供方向。

鑒于法醫(yī)學(xué)鑒定受死亡時間、取材部位、年齡及性別等多種因素影響，因而窒息特異性標志物的篩選仍有待大量實驗來驗證。而且由于circRNA表達豐度較低，因而利用circRNA標志物進行窒息死亡原因的推斷作為一種新的方法，如何應(yīng)用于人尸體方面依然存在著研究上的空白，需要進一步深入探索。