吳 瑕，龔國利，查 健

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021)

抗生素是對抗細菌感染的有力武器，其廣泛使用拯救了無數(shù)生命，也極大提高了人類生活水平。然而，抗生素的過度使用已引發(fā)一系列嚴重問題，包括耐藥菌甚至“超級細菌”的涌現(xiàn)。此外，作為典型的廣譜抗菌藥物，抗生素的使用易引起人體腸道菌群失調(diào)。為此，新型高效窄譜抗菌劑的開發(fā)具有重要的醫(yī)學(xué)及社會價值[1]。

噬菌體療法起源于20世紀20年代，但由于質(zhì)控困難，被抗生素療法逐漸替代[2]。近年來，伴隨著耐藥細菌的肆虐，噬菌體療法以其高效性再次引起關(guān)注[3-4]。然而，噬菌體具有潛在的生物安全隱患，現(xiàn)有技術(shù)難以保證其效用的穩(wěn)定發(fā)揮，不利于該方法的推廣[4-5]。噬菌體殺菌作用的發(fā)揮主要取決于其所產(chǎn)生的噬菌體裂解酶，一類細菌細胞壁水解酶。相比于噬菌體，酶的可操作性及可控性較強，穩(wěn)定高效酶制劑的制備相對容易[4]。目前，噬菌體裂解酶以及其他細菌細胞壁水解酶(統(tǒng)稱細菌裂解酶)在小鼠、兔子等動物模型中已展現(xiàn)出優(yōu)異、專一的抗菌性能。這些酶對耐藥菌株有效，且不易誘發(fā)菌體抗性，被視為抗生素的一種可能的替代品[1,6-8]。本文中,筆者簡要介紹以細菌裂解酶為基礎(chǔ)的功能性生物材料的制備及其在食品加工、病原細菌檢測、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面的應(yīng)用。

1 細菌裂解酶

細菌裂解酶(bacteriolytic enzymes，lytic enzymes)是一類天然存在的高特異性細菌細胞壁水解酶，通過高效識別并降解特定結(jié)構(gòu)的細胞壁肽聚糖，引起細菌快速破裂、死亡[1]。雖然肽聚糖在不同物種間具有相似的基本結(jié)構(gòu)，然而，不同細菌、甚至同種細菌的不同菌株之間，在肽聚糖的交聯(lián)度、肽鏈的組成及鏈長、糖鏈的組成單元、低豐度糖單元的含量及排列方式等方面有顯著差異[9]，此差異可保證細菌裂解酶的高選擇性，即一個酶只裂解一種或少數(shù)幾種細菌。

細菌裂解酶按照活性可分為糖苷酶、酰胺酶和肽酶三大類[1,6]。糖苷酶斷裂糖苷鍵，按照其作用位點可分為氨基葡萄糖苷酶(1)(降解從N-乙酰葡糖胺到N-乙酰胞壁酸的β-1,4糖苷鍵)、N-乙酰胞壁質(zhì)酶(2)(溶菌酶，可降解從N-乙酰胞壁酸到N-乙酰葡糖胺的β-1,4糖苷鍵)、裂解性糖基轉(zhuǎn)移酶(3)(切斷從N-乙酰胞壁酸到N-乙酰葡糖胺的β-1,4糖苷鍵，并在N-乙酰胞壁酸形成一個分子內(nèi)糖苷鍵，嚴格意義上不屬于水解酶)[6]。酰胺酶(4)作用于N-乙酰胞壁酸與肽鏈相連部位的酰胺鍵。肽酶(5)主要為內(nèi)肽酶活性，作用于與糖鏈相接的肽鏈，或者兩條肽鏈交聯(lián)形成的肽橋(圖1)。

細菌裂解酶按照來源劃分，主要分為病毒相關(guān)裂解酶(virion-associated lysin,VAL)、噬菌體裂解酶(endolysin)、細菌自溶素(autolysin)和Ⅲa類細菌素(bacteriolysin)四大類[1]。病毒相關(guān)裂解酶作用于噬菌體侵染初期，在局部降解細菌細胞壁，協(xié)助噬菌體將其基因組注入宿主細胞。此類酶通常為噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白，分子量大，且熱穩(wěn)定性強[10-11]。噬菌體裂解酶作用于侵染末期，從宿主細胞內(nèi)部降解細胞壁，使子代噬菌體得以釋放[12-13]。細菌自溶素由細菌產(chǎn)生作用于自體，在細胞壁的合成、更新、重構(gòu)以及細胞分裂等方面發(fā)揮重要作用[14]。Ⅲa類細菌素由一種細菌產(chǎn)生并分泌到胞外，作用于有競爭關(guān)系的另一種細菌，以抑制其生長[1,15]。

對抗革蘭氏陰性菌的細菌裂解酶具有多樣化的結(jié)構(gòu)。相比之下，對抗革蘭氏陽性菌的細菌裂解酶通常具有較為規(guī)整的模塊化結(jié)構(gòu)，其N端具有至少一個催化域(catalytic domain)，可選擇性地切斷肽聚糖的某一特定化學(xué)鍵；C端具有至少一個底物結(jié)合域(cell wall-binding domain,CBD)，可特異性地識別并結(jié)合具有特定結(jié)構(gòu)的肽聚糖[1]。兩個區(qū)域互補卻互不干擾，可獨立存在并保持各自功能，這一特性有利于細菌裂解酶的嵌合化改造[16]。目前，已有諸多研究將不同細菌裂解酶的活性域和底物結(jié)合域進行隨機組合，創(chuàng)造出自然界中不存在的、具有新型細胞壁裂解活性或新型底物特異性的嵌合酶[17-20]。

圖1 細菌細胞壁結(jié)構(gòu)及細菌裂解酶作用位點Fig.1 Schematic diagram of bacterial cell wall structure and the cleavage sites of various bacteriolytic enzymes

2 基于細菌裂解酶的功能性生物材料的制備

目前，基于細菌裂解酶的應(yīng)用研究主要集中于噬菌體裂解酶和Ⅲa類細菌素兩大類。這些酶大多穩(wěn)定性差，無法耐受蛋白酶、表面活性劑、持續(xù)加熱等處理，故而在實際生產(chǎn)生活環(huán)境中的應(yīng)用受到極大限制。通過固定化的方法將酶結(jié)合于特定材料表面或內(nèi)部，一方面可提高酶穩(wěn)定性，拓展其使用范圍，另一方面可賦予這些材料特殊的生物學(xué)功能，使其成為功能性生物材料。對于細菌裂解酶與材料的結(jié)合，常用的固定化方法為包埋、共價結(jié)合以及親和配基結(jié)合(圖2)[21-23]。

圖2 細菌裂解酶的常用固定化方法Fig.2 Commonly used strategies for immobilization of bacteriolytic enzymes

包埋式固定化利用凝膠或高分子聚合物等材料的溶脹或聚合性質(zhì)，將酶分子包裹在多孔載體內(nèi)部，可有效保持酶分子的結(jié)構(gòu)和功能完整性，防止其與蛋白酶等有害物質(zhì)接觸(圖2)。當酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物是大分子時，擴散成為主要的限制性因素，故孔隙率的優(yōu)化至關(guān)重要[24]。細菌裂解酶的底物為細菌細胞，具有微米級尺寸且不溶于水，因此，細菌裂解酶的包埋式固定化多被作為可控釋放體系，使固定化的酶與細胞實現(xiàn)物理隔離，而受到應(yīng)激釋放的酶可與細胞保持良好接觸，從而發(fā)揮其抗菌功效。例如，噬菌體裂解酶LysK的活性域CHAPk以及Ⅲa類細菌素溶葡球菌酶(lysostaphin，Lst)可高效對抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，金葡菌)。這兩種酶被包埋在溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺材料中，在36 ℃時材料融化，釋放出的酶可快速殺死金葡菌[25]。

傳統(tǒng)的共價結(jié)合法利用酶分子上的活性官能團(—OH、—NH2等)與固定化載體上的化學(xué)基團進行反應(yīng)，形成共價鍵，使酶分子緊密固定在材料上。該方法結(jié)合力強，酶分子不易脫落，可用于復(fù)雜環(huán)境下(變性劑、表面活性劑或強酸強堿等物質(zhì)存在時)的酶促反應(yīng)(圖2)[21,26]。然而，活性官能團在酶分子氨基酸側(cè)鏈上分布廣泛，因此，固定化位點雜亂且不可預(yù)測，導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)改變、活性下降[27-28]。細菌裂解酶多具有特殊的模塊化結(jié)構(gòu)，且其作用底物為細菌細胞，酶分子需要保持足夠的柔性，以便與底物有效結(jié)合。為此，可在載體和酶分子之間引入適當長度的連接體[29-30]。Pangule等[31]在羧基修飾的多壁碳納米管上共價固定Lst，發(fā)現(xiàn)酶的抗金葡菌活性幾乎喪失。通過在酶與碳納米管之間引入聚乙二醇連接體，酶活性極大提高。然而，連接體的嵌入依賴化學(xué)反應(yīng)，嵌入位點隨機，使得同一批次固定化酶的結(jié)構(gòu)及固定方式不均一。

利用親和配基進行非共價強相互作用結(jié)合，是近年發(fā)展起來的一種新型表面固定化方法。親和配基可通過基因工程的方法便捷精確地添加于酶分子的任何所需位置，與含有對應(yīng)受體的材料通過親和作用形成緊密結(jié)合，可最大限度保持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定(圖2)。該固定化過程可在溫和條件下通過孵育完成，對酶分子無變性作用[32-36]。如需在酶與親和配體之間引入連接體，可在基因?qū)用婕尤脒m當長度的連接肽基因，保證酶分子的柔性，防止親和配基或受體對酶結(jié)構(gòu)造成干擾。較常用的親和配基有組氨酸標簽、材料結(jié)合肽等。Yerosiavsky等[37]將帶有C端組氨酸標記的Lst與聚多巴胺修飾的玻璃片在磷酸緩沖液(pH 7.4)中孵育48 h，即可實現(xiàn)Lst在玻璃材料表面的有效固定及其活性的有效保持。Wu等[38]將Lst的C端融合SiO2結(jié)合肽，與玻璃片在室溫條件下在含有400 mmol/L NaCl、0.3% (體積分數(shù)) Tween 20的磷酸緩沖液(pH 7.4)中孵育1 h，可將Lst固定于玻璃表面。然而，直接固定的Lst活性喪失嚴重。通過添加柔性連接肽，固定化的Lst可在3 h內(nèi)實現(xiàn)99.99%的殺菌率，比游離酶或不加柔性連接肽的固定化酶具有更高的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性[38]。

3 細菌裂解酶基生物材料的應(yīng)用

將細菌裂解酶固定于材料表面或內(nèi)部，制備細菌裂解酶基生物材料，在保證抗菌活性及特異性的同時，還可有效穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)及功能，極大地拓展了其應(yīng)用范圍，在食品檢測與加工、疾病診療、環(huán)境除菌等方面有良好的應(yīng)用前景。

3.1 食品加工

食品中常見的一種污染性致病細菌為李斯特桿菌，其感染可在短時間內(nèi)引起死亡，因此，多國的食品監(jiān)管機構(gòu)都對其實行“零容忍”。為提高食品加工過程的安全性，減少李斯特桿菌污染，Solanki等[39]選取由美國FDA批準可在食品行業(yè)使用的硅納米顆粒(silica nanoparticles,SiNPs)，將李斯特桿菌(Listeriamonocytogenes)裂解酶Ply500共價結(jié)合于其表面，制成Ply500-SiNP復(fù)合材料，可有效清除游離的李斯特桿菌。進一步將Ply500-SiNP包埋于聚甲基丙烯酸羥乙酯，形成選擇性抗菌膜，既可殺死游離的李斯特桿菌，又可抑制其在材料表面或生菜葉片上附著生長，故可用作食品加工設(shè)備的涂層，或用于食品包裝。此外，該課題組在Ply500的N端融合麥芽糖結(jié)合蛋白，利用親和作用將其固定于淀粉納米顆粒表面，可在24 h內(nèi)殺滅99.9%的游離李斯特桿菌。該技術(shù)可用于生產(chǎn)可食用的抗菌食品包裝材料。

3.2 病原細菌的檢測

病原細菌的檢測包括定量檢測和定性檢測。以抗體為核心的定性檢測技術(shù)通常不能很好地區(qū)分同一細菌的不同亞型[40]，細菌裂解酶可有效解決這一問題。Loessner課題組的Schmelcher等[41]首先選取了一系列李斯特桿菌裂解酶，可分別識別李斯特桿菌的不同血清型；其次，將這些酶的底物結(jié)合域分別融合于不同的熒光蛋白，構(gòu)建出融合蛋白庫。最后，通過同時選用兩種融合蛋白，結(jié)合熒光顯微技術(shù)，即可在混菌體系中精確快速地定性檢測并有效區(qū)分李斯特桿菌的特定血清型。

定量過程通常涉及細菌細胞的富集及計數(shù)分析，較常用的方法包括基于抗體的免疫磁珠分離技術(shù)以及基于PCR的基因檢測技術(shù)。然而，前者檢測限較高，且常伴有非特異性識別[42]，后者不能有效區(qū)分死菌和活菌，且檢測過程常受到待檢樣品(如食品、血液)中某些成分的干擾[43]。細菌裂解酶對細菌細胞的高特異性及高親和力使其在檢測領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。Kwon等[44]選用金葡菌裂解酶Lst,、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)裂解酶AmiBA2446以及英諾克李斯特桿菌(Listeriainnocua)裂解酶Ply500，將其底物結(jié)合域分別加上生物素標簽，同時對葡萄糖氧化酶(GOx)進行生物素標記，將兩者共結(jié)合于鏈霉親和素(SA)，制成CBD-SA-GOx復(fù)合蛋白體系，在混菌體系中與對應(yīng)菌體結(jié)合并與雜菌分離后，可在葡萄糖存在條件下利用產(chǎn)生的H2O2實現(xiàn)相應(yīng)細菌的快速定量檢測，檢測限可達到103～104cfu/mL。為進一步提高檢測靈敏度并降低檢測限，該研究將GOx替換為DNA條碼，通過實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)可在混菌體系中檢出<10 cfu/mL的特定細菌，在真實樣品中(脫脂牛奶、10%人血漿或5%牛肉提取物)保持相同的靈敏度和檢測限。這兩種檢測方法操作簡單，可在數(shù)小時內(nèi)完成。

3.3 疾病治療

目前，著眼于醫(yī)療用途的細菌裂解酶基生物材料的開發(fā)主要集中于金葡菌感染。金葡菌是一類常見致病菌，其感染可引起傷口膿腫、皮膚大面積潰爛等癥狀，嚴重時可導(dǎo)致全身敗血癥、器官衰竭，甚至死亡。金葡菌極易對抗生素產(chǎn)生耐受性，使得臨床治療周期長、難度大、復(fù)發(fā)率高。Lst對金葡菌有極強的殺菌效果，故而被廣泛用于抗金葡菌生物材料的開發(fā)。

Miao等[45]將Lst共價固定于纖維素納米纖維表面，在體外皮膚細胞模型中可有效清除金葡菌，有望用作消毒繃帶，在傷口處預(yù)防金葡菌感染。在另一項針對皮膚傷口感染的研究中，Hathaway等[25]利用感染部位皮膚溫度由32 ℃升至37 ℃的現(xiàn)象，將Lst和CHAPk包埋在溫敏型材料聚N-異丙基丙烯酰胺中，該材料在36 ℃融化，釋放出兩種細菌裂解酶，可在感染部位迅速殺死金葡菌，達到治療效果。

對于長期使用體內(nèi)植入器具(如導(dǎo)尿管)的病人，器具與人體細胞的接觸部位為細菌附著生長提供了有利條件，嚴重危害人體健康。具有銀涂層的植入器具可一定程度抑制細菌生長，然而，其長期使用效果欠佳[46-47]。使用非特異性抗菌酶(如可產(chǎn)生H2O2的纖維二糖脫氫酶)作為涂層[48]，可破壞植入環(huán)境中正常菌群的生長。在一項針對人工植牙的研究中，Nileback等[49]將金葡菌裂解酶PlySs2和SAL-1固定于絲蛋白涂層，可預(yù)防金葡菌在涂層上的附著生長。在針對疝病的研究中，Satishkumar等[50]將Lst吸附于聚丙烯材質(zhì)的疝病修護網(wǎng)表面，一方面可清除周圍環(huán)境中的游離金葡菌，另一方面可抑制金葡菌的附著，在小鼠模型中亦展現(xiàn)出良好的效果。

3.4 環(huán)境除菌

社區(qū)、醫(yī)院和學(xué)校等人口密集的公共場所是細菌感染的重要傳播源頭。保障公共環(huán)境清潔衛(wèi)生，是從源頭減少細菌感染的有效方法之一。傳統(tǒng)的公共環(huán)境消毒采用酒精、甲酸或次氯酸等化學(xué)試劑，氣味重，且不具有選擇性，將有益細菌和有害細菌一并殺滅。在門把手、水龍頭等接觸性部件添加含銀涂層，殺菌效果較弱，且同樣不具有選擇性。

為利用細菌裂解酶的高特異性進行環(huán)境消毒，Pangule等[31]將Lst共價結(jié)合于碳納米管表面并制成乳膠涂膜，可在6 h內(nèi)殺死金葡菌的普通菌株及耐藥菌株。該材料可在干燥環(huán)境中使用至少6個月并完全保持抗菌性能，有望作為優(yōu)良的抗菌涂層在公共環(huán)境使用。Wu等[38]將Lst通過親和作用固定在NiNTA瓊脂糖顆粒表面，在工業(yè)表面活性劑存在條件下仍能有效殺死金葡菌，有望制成除菌噴霧，或添加于抗菌洗手液中。另一項研究中，Kim等[51]將金葡菌裂解酶Lst和炭疽芽孢桿菌裂解酶PlyPH的底物結(jié)合域通過銀結(jié)合肽分別固定于銀納米顆粒表面，賦予銀納米材料選擇性殺菌特性，使其可在對應(yīng)細菌細胞表面富集，以較低濃度實現(xiàn)高效殺菌。該方法及其拓展策略有利于對玻璃、陶瓷和不銹鋼等材料表面進行抗菌修飾，有望作為抗菌涂層使用于接觸性公共設(shè)施表面。

4 結(jié)論與展望

細菌裂解酶是一類細菌細胞壁水解酶，對細菌細胞有強大的殺菌功效，高效、溫和、特異性強、對耐藥細菌有效，且靶向菌體不易對其產(chǎn)生耐受性，有望成為新一代抗菌劑，緩解耐藥細菌感染帶來的一系列問題。盡管細菌裂解酶在許多動物模型中已展現(xiàn)出優(yōu)異的殺菌性能，并且?guī)追N金葡菌裂解酶正處于人體臨床試驗階段，但是，細菌裂解酶在真實環(huán)境中的使用仍然存在一系列問題。首先，細菌裂解酶具有免疫原性，可在生物體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生嚴重的后果，故應(yīng)對酶進行特殊處理；其次，細菌裂解酶作為蛋白質(zhì)，可被生物體內(nèi)的蛋白酶降解，因此，有必要對酶進行修飾或改造，以減少其降解，延長其半衰期；再次，細菌裂解酶在生物體內(nèi)的使用通常需要依賴較高的酶濃度，以達到較好的殺菌效果，且研究表明，細菌在血液、小腸等真實環(huán)境中對細菌裂解酶的敏感性降低[52]；最后，酶作為抗菌劑的生產(chǎn)及使用成本較高，相比于傳統(tǒng)抗生素，酶穩(wěn)定性較差。這些問題都限制了細菌裂解酶的大規(guī)模使用。然而，細菌裂解酶可以作為現(xiàn)有抗菌劑的補充，在耐藥細菌感染的防治領(lǐng)域發(fā)揮作用。

目前，細菌裂解酶的相關(guān)研究主要集中在游離酶的發(fā)現(xiàn)、鑒定、性能表征和工程化改造等方面，以其為基礎(chǔ)制備功能性生物材料的研究為數(shù)不多?；诩毦呀饷傅墓δ苄陨锊牧鲜且环N新型生物材料，在食品加工、細菌檢測、抗菌等方面有良好的應(yīng)用前景，相比于這些領(lǐng)域使用的傳統(tǒng)生物材料(如基于溶菌酶或多聚賴氨酸的抗菌生物材料)，具有更高的底物特異性和更強的酶-底物結(jié)合力。

細菌裂解酶基生物材料的開發(fā)關(guān)鍵在于選擇合適的載體材料、合適的固定化方法以及合適的連接肽，使固定化的酶保持高度的柔性及選擇性抗菌活性或底物結(jié)合特異性。此外，根據(jù)該復(fù)合材料的具體用途及使用環(huán)境，需要考慮材料的安全性、穩(wěn)定性、與使用環(huán)境中其他物質(zhì)的相容性、重復(fù)利用率等因素；如用作臨床治療，還需考慮酶的免疫原性。隨著新材料的出現(xiàn)以及新型固定化技術(shù)的建立，基于細菌裂解酶的新型生物材料的開發(fā)周期將縮短，應(yīng)用范圍也將極大拓展。