景曉冉，聶 堯，徐 巖，2

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hpro)是藥物合成中一種重要的中間體[1-3]，可以用來合成碳青霉烯類抗生素類高附加值藥物[4-5]，同時(shí)在材料化工、食品營(yíng)養(yǎng)和護(hù)膚美容方面也具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[6-7]。目前，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物合成trans-4-Hpro的研究引起人們的廣泛關(guān)注。

1995年，Serizawa等[8]發(fā)現(xiàn)一株可被命名為ClonostachyscylindrosporaSANK 14591的菌株，外源添加L-脯氨酸(L-Pro)可以合成13.8 mg/L的trans-4-Hpro。1996年，Lawrence等[9]從StreptomycesgriseoviridusP8648 中純化出脯氨酸4-羥化酶，并對(duì)該酶的特性進(jìn)行了初步研究，每毫克蛋白每分鐘的羥脯氨酸產(chǎn)量?jī)H為907 pmol/L。2000年，Shibasaki等通過全細(xì)胞酶活測(cè)定篩選出來源于Dactylosporangiumsp. RH1活性最高的P4H[10]，以Escherichiacoli(E.coli)W1485 作為宿主菌進(jìn)行重組表達(dá)，并以E.coliW1485 pTrS2-4OH為菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中外源添加L-Pro獲得了15 g/L的trans-4-Hpro[11]。2006年，Bontoux等[12]在反應(yīng)體系中添加10 mmol/L的L-Pro為底物，在250株野生菌中篩選出5株可轉(zhuǎn)化生成trans-4-Hpro，產(chǎn)率均在5%～10%。2013年，劉合棟等[13]將優(yōu)化后的P4H基因插入含有色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子的pUC19 質(zhì)粒，并導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)中，在搖瓶水平添加200 mmol/L L-Pro為底物發(fā)酵8 h，可積累0.492 g/L 的trans-4-Hpro。2017年，周海巖等[14]將源于BradyrhizobiumjaponicumUSDA 6的脯氨酸4-羥化酶在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行重組構(gòu)建，采用全細(xì)胞催化反應(yīng)體系，經(jīng)過體系的優(yōu)化，trans-4-Hpro的合成量達(dá)到34.86 mg/L。

雖然目前已有許多生物催化轉(zhuǎn)化羥基脯氨酸研究的相關(guān)報(bào)道，但能夠高效羥基化L-Pro的酶資源仍然有限。微生物合成法生產(chǎn)trans-4-Hpro的過程中，菌體生長(zhǎng)緩慢，很難達(dá)到高密度發(fā)酵，L-Pro的有效轉(zhuǎn)化率較低，從而造成生產(chǎn)原料的浪費(fèi)。本研究中，筆者利用功能酶基因探礦方法挖掘獲得羥基化L-Pro的新型Fe(II)/2-酮戊二酸(2-OG)依賴型雙加氧酶KaPH1，對(duì)羥基化酶表達(dá)和反應(yīng)耦聯(lián)過程進(jìn)行調(diào)控，通過監(jiān)測(cè)體系中菌體生長(zhǎng)、蛋白表達(dá)及底物轉(zhuǎn)化進(jìn)程，以期實(shí)現(xiàn)在不添加共底物2-OG的情況下L-Pro的高效轉(zhuǎn)化，為生物合成trans-4-Hpro高效轉(zhuǎn)化體系的建立提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Kutzneriaalbida(白色庫(kù)茨涅爾氏菌)，中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)；E.coliJM109和E.coliBL21(DE3)保存于本實(shí)驗(yàn)室；表達(dá)載體pET-28a，Novagen公司；克隆載體pMD-19T、限制性內(nèi)切酶和連接酶，TaKaRa公司；PCR純化試劑盒、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，OMEGA生物科技公司；E.colipET-28a-KaPH1(E.coliKaPH1)、E.colipET-28a-P4H(E.coliP4H)本研究中構(gòu)建；標(biāo)準(zhǔn)品L-Pro、trans-4-Hpro、順式-4-羥基-L-脯氨酸(cis-4-Hpro)，美國(guó)Sigma 公司；卡那霉素、IPTG，上海生工生物技術(shù)有限公司；其他分析純?cè)噭?，?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR引物、P4H的基因序列由上海睿迪生物科技有限公司合成。

Mastercycler nexus X2型PCR儀，Eppendorf公司；GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀，Thermo公司；pH計(jì)，美國(guó)Mettler Toledo公司；Waters 2695型高效液相色譜儀，沃特世科技有限公司；Waters ACQUITY UPLC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，沃特世科技有限公司；Avance 400型核磁共振波譜儀，Bruker公司；JY-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物公司；UV-3102PC型分光光度儀，美國(guó)UNIC公司；Avanti J-E型冷凍高速離心機(jī)，Beckman Coulter公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 目的基因片段的獲得

參照大腸桿菌密碼子偏好性、GC含量，對(duì)來源于Dactylosporangiumsp.的脯氨酸4-羥基化酶基因(P4H，GenBank No.BAA20094.1)進(jìn)行序列的優(yōu)化和設(shè)計(jì)，將合成的基因片段連接到表達(dá)載體pET-28a中。

利用基因挖掘工具，將已報(bào)道的P4H在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)后，選取與其序列同源性為51%的基因作為候選基因進(jìn)行重組克隆表達(dá)。以Kutzneriaalbida的全基因組為模板，以KaPH1-F-NdeⅠ(5’-T￣G￣C￣A￣T￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣C￣T￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣T￣T￣C￣G￣C￣A￣G￣T-3)和KaPH1-R-HindⅢ(5’-T￣T￣A￣A￣G￣C￣T￣T￣T￣C￣A￣T￣G￣C￣G￣C￣C￣C￣A￣G￣G￣C-3’)為引物，擴(kuò)增目的片段KaPH1。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 22 μL，引物F(50 pmol/μL) 1 μL，引物R(50 pmol/μL) 1 μL，基因組DNA 1 μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL。PCR反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 10 s，47 ℃ 5 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。用PCR純化試劑盒純化DNA片段，將獲得的基因片段連接到克隆載體pMD-19T中。

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ對(duì)克隆載體pMD-19T-KaPH1和表達(dá)載體pET-28a分別進(jìn)行雙酶切，回收目的片段用T4 DNA連接酶于20 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含50 μg/mL 卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取陽性克隆子，經(jīng)菌落PCR和DNA測(cè)序驗(yàn)證正確后，將重組質(zhì)粒pET-28a-P4H、pET-28a-KaPH1分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組菌E.coliP4H和E.coliKaPH1。

1.2.3 重組大腸桿菌的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組大腸桿菌單菌落接種至5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜，并以2%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，為了探究重組菌株目的蛋白最優(yōu)的表達(dá)條件，設(shè)置添加的IPTG濃度為0.1、0.5和1.0 mmol/L，并將誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為20、25和30 ℃，于200 r/min 下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后通過SDS-PAGE檢驗(yàn)蛋白可溶性表達(dá)情況[15]。

1.2.4 全細(xì)胞酶活測(cè)定方法

酶活測(cè)定體系(mmol/L)：葡萄糖20，L-Pro 20，L-抗壞血酸5，2-OG 20，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，MgSO47H2O 2，CaCl20.5；加入一定量的全細(xì)胞，在28 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)30 min，測(cè)定體系中trans-4-Hpro的生成量。

酶活定義：在28 ℃下，1 min生成1 mmol/Ltrans-4-Hpro所需要的全細(xì)胞的量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

1.2.5E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化合成trans-4-Hpro

全細(xì)胞反應(yīng)體系(mmol/L)：葡萄糖20，L-Pro 20，L-抗壞血酸5，2-OG 20，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，MgSO4·7H2O 2，CaCl20.5，菌體質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，初始 pH 7.0。將經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心，稱取濕菌體質(zhì)量，然后用MES緩沖液將細(xì)胞沖洗懸浮后，在28 ℃搖床中200 r/min培養(yǎng)24 h，然后在沸水中加熱2 min，滅活菌體，終止酶反應(yīng)，測(cè)定體系中trans-4-Hpro產(chǎn)量[16]。

分別在不同溫度梯度(20、25、30、35、40和50 ℃)和pH梯度下測(cè)定重組菌E.coliKaPH1全細(xì)胞活性，探究反應(yīng)體系的溫度和pH對(duì)trans-4-Hpro合成的影響。不同pH梯度的反應(yīng)體系分別采用100 mmol/L MES-Tris緩沖液(pH 3.5～7)和100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7～9)。

分別在不同2-OG濃度梯度(0～45 mmol/L)、Fe2+濃度梯度(0～3.5 mmol/L)和L-抗壞血酸濃度梯度(0～30 mmol/L)下測(cè)定重組菌E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化體系中trans-4-Hpro產(chǎn)量，探究轉(zhuǎn)化體系中共底物和輔因子對(duì)trans-4-Hpro合成的影響。

考察轉(zhuǎn)化體系中的葡萄糖濃度(0～50 mmol/L)和CaCl2濃度(0～4 mmol/L)對(duì)重組菌E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化L-Pro活性的影響。

1.2.6 表達(dá)和反應(yīng)耦聯(lián)合成trans-4-Hpro的過程調(diào)控

取重組大腸桿菌單菌落接種至5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜，并以6%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 含50 mg/L卡那霉素的自誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基(添加一定濃度的L-Pro)的500 mL擋板錐形瓶中，于37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h后，于20 ℃、225 r/min培養(yǎng)80 h，將發(fā)酵液離心，測(cè)定發(fā)酵上清中trans-4-Hpro的產(chǎn)量[16]。

對(duì)體系中產(chǎn)酶和催化耦聯(lián)過程進(jìn)行溫度階段性調(diào)控，在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)分別控制表達(dá)和轉(zhuǎn)化最適溫度條件的時(shí)間，確定最優(yōu)調(diào)控途徑。

在不同誘導(dǎo)劑濃度(10～30 mmol/L乳糖)下測(cè)定trans-4-Hpro的產(chǎn)量及全細(xì)胞的酶活，考察乳糖濃度對(duì)重組菌株E.coliKaPH1合成trans-4-Hpro的影響。

對(duì)耦聯(lián)轉(zhuǎn)化體系中底物 L-Pro設(shè)置濃度梯度(20～100 mmol/L)，考察體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量和生物量(OD600)的變化，以分析底物濃度的增加對(duì)重組菌株E.coliKaPH1生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化L-Pro活性的影響。

1.2.7 底物和產(chǎn)物的分析

使用芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)柱前試劑對(duì)樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)[17]，終止反應(yīng)后用于HPLC 檢測(cè)。底產(chǎn)物的分析方法：Diomansil C18 柱(250 mm×4.6 mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)263 nm，流動(dòng)相A 為(0.05 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.2)與乙腈的體積比90∶ 10)，流動(dòng)相B 為(0.05 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.2)與乙腈的體積比20∶ 80)，流動(dòng)相A和流動(dòng)相B采用梯度洗脫程序，流速1.0 mL/min。

1.2.8 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

采用液相色譜-質(zhì)譜( LC-MS)聯(lián)用技術(shù)及核磁共振儀(NMR) 對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。LC-MS 條件：采用液質(zhì)聯(lián)用儀Waters ACQUITY UPLC-MS/MS系統(tǒng)，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS C18反相色譜柱(1.8 μm)。流動(dòng)相A為0.02 mol/L NH4Ac-HAc緩沖液(pH 4.2)，流動(dòng)相B為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。流速200 μL/min，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 5 μL。將10 mg的產(chǎn)物粉末溶于600 μL D2O后，轉(zhuǎn)移至直徑為5 mmol/L核磁管。由核磁共振波譜儀測(cè)定核磁共振氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)[18]，反應(yīng)產(chǎn)物核磁數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 化合物的核磁共振氫譜及碳譜分析

2 結(jié)果與討論

2.1 羥基化酶的表達(dá)及其催化合成轉(zhuǎn)化trans-4-Hpro

在前期研究工作中，筆者利用基因挖掘工具基于已報(bào)道的P4H序列通過同源序列比對(duì)獲得K.albida來源的新型羥基化酶KaPH1(GenBank No.WP_030110684.1)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定[19]。功能性驗(yàn)證試驗(yàn)表明KaPH1可將L-Pro高效地立體選擇性羥基化形成trans-4-Hpro，KaPH1純化后的蛋白條帶大小約為2.9×104，其最適pH為6.5，最適溫度為30 ℃；以L-Pro為底物，其Km和kcat值分別為1.07 mmol/L和 0.54 s-1[19]。在本研究中，筆者進(jìn)一步對(duì)重組菌E.coliKaPH1的表達(dá)條件進(jìn)行探究，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，E.coliKaPH1在分子量3×104處發(fā)現(xiàn)一條明顯的條帶，與目標(biāo)條帶分子量大小一致。通過對(duì)E.coliKaPH1表達(dá)條件優(yōu)化，結(jié)果表明：KaPH1在25和30 ℃條件下蛋白的總表達(dá)量較高，但是在上清中無法觀察到明顯目的條帶，大部分呈現(xiàn)為包涵體的形式；相比之下，KaPH1在20 ℃條件下雖然蛋白的總表達(dá)量較少，但可溶性表達(dá)效果最好。在考察的IPTG濃度(0.1、0.5、1 mmol/L)下，E.coliKaPH1均可表達(dá)可溶性的KaPH1，0.5和1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量一致且明顯高于0.1 mmol/L IPTG濃度下的蛋白表達(dá)量。由此確定E.coliKaPH1最適表達(dá)條件：20 ℃、0.5 mmol/L IPTG。

(a) M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1、2—在20 ℃條件下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；3、4—在25 ℃條件下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；5、6—在30 ℃條件下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；(b) 1′、2′—0.1 mmol/L IPTG濃度下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；3′、4′—0.5 mmol/L IPTG濃度下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；5′、6′—1 mmol/L IPTG濃度下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白圖1 重組大腸桿菌E.coli KaPH1在不同溫度(a)和IPTG濃度(b)誘導(dǎo)下的異源表達(dá)情況Fig.1 Heterologous expression of E.coli KaPH1 induced at different temperature (a) and IPTG concentration (b)

L-Pro的羥基化過程需要分子氧、2-OG和Fe2+等輔因子和共底物的協(xié)同作用[11]，L-Pro的羥基化過程與共底物2-OG的脫羧反應(yīng)耦聯(lián)進(jìn)行。本研究采用E.coliKaPH1全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，通過外源添加底物、共底物和輔因子等，對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化L-Pro的活性進(jìn)行比較分析。

在全細(xì)胞體系中加入20 mmol/L的L-Pro作為底物，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量來比較重組菌株E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化L-Pro的活性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在反應(yīng)前期階段，E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化體系中trans-4-Hpro迅速積累，在反應(yīng)12 h后臨近反應(yīng)終點(diǎn)，體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量最終達(dá)到1 051 mg/L，轉(zhuǎn)化率為40.1%；與此同時(shí)，對(duì)照E.coliP4H菌株反應(yīng)體系中trans-4-Hpro的積累量也達(dá)到825 mg/L，轉(zhuǎn)化率為31.4%。全細(xì)胞反應(yīng)轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，在相同菌體濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)下，重組菌株E.coliKaPH1展現(xiàn)出很高的L-Pro轉(zhuǎn)化活性。在接下來的研究中，筆者將對(duì)E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化體系中影響trans-4-Hpro合成的因素進(jìn)行探究，并對(duì)產(chǎn)酶和催化耦聯(lián)過程進(jìn)行調(diào)控。

圖2 E.coli KaPH1轉(zhuǎn)化合成trans-4-Hpro的活性驗(yàn)證Fig.2 Catalytic activity of E.coli KaPH1 for trans-4-Hpro synthesis

2.2 E.coli KaPH1轉(zhuǎn)化體系調(diào)控結(jié)果

為探究轉(zhuǎn)化合成trans-4-Hpro過程中的影響因素，通過對(duì)反應(yīng)條件及轉(zhuǎn)化體系中各組分的濃度進(jìn)行調(diào)控，檢測(cè)E.coliKaPH1活性或體系中trans-4-Hpro產(chǎn)量的變化。

2.2.1 溫度和pH對(duì)E.coliKaPH1 活性的影響

為了考察反應(yīng)溫度及pH對(duì)E.coliKaPH1活性的影響，在其他因素不變的條件下，分別設(shè)置溫度梯度(20、25、30、35、40和50 ℃)及pH梯度(MES緩沖液pH 3.5～7，Tris-HCl緩沖液pH 7～9)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在25～40 ℃溫度范圍內(nèi)，E.coliKaPH1活性維持在75%以上，并在30 ℃時(shí)達(dá)到最高值。在溫度低于30 ℃時(shí)，E.coliKaPH1活性隨著溫度的升高逐漸升高；在溫度高于30 ℃時(shí)，E.coliKaPH1的活性逐步降低，在50 ℃時(shí)，E.coliKaPH1活性損失超過了50%。

在pH 3.5～5.0范圍內(nèi)，E.coliKaPH1活性很低維持在25%以下，E.coliKaPH1活性在pH 5.5時(shí)迅速上升，并在pH 6.5時(shí)達(dá)到最高；在pH 7.0～9.0范圍內(nèi)，E.coliKaPH1活性下降，且活性測(cè)定體系的顏色發(fā)生變化(Fe2+在堿性環(huán)境下發(fā)生反應(yīng))。綜上，本研究選擇30 ℃和pH 6.5為接下來單步轉(zhuǎn)化體系的反應(yīng)條件。

2.2.2E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化體系各組分對(duì)trans-4-Hpro合成的影響

圖3 溫度(a)和pH(b)對(duì)E.coli KaPH1 活性的影響Fig.3 Effect of temperature (a) and pH (b) on E.coli KaPH1 activity

1)2-OG對(duì)trans-4-Hpro合成的影響。Trans-4-Hpro合成是由酶促羥基化反應(yīng)與2-OG氧化脫羧反應(yīng)相耦聯(lián)[20]，通過改變反應(yīng)體系中2-OG的添加量探究其對(duì)重組菌的轉(zhuǎn)化活性及trans-4-Hpro合成的影響。由于2-OG具有極大的酸性，使用Tris將2-OG母液的pH調(diào)至7.0再添加至體系中，結(jié)果如圖4(a)所示。由圖4(a)可知，當(dāng)2-OG的濃度在0～30 mmol/L變化時(shí)，2-OG對(duì)trans-4-Hpro的產(chǎn)生具有顯著的促進(jìn)作用，在20 mmol/L處產(chǎn)量達(dá)到最高，為1 220 mg/L。隨著2-OG濃度的繼續(xù)增加，trans-4-Hpro的產(chǎn)量增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯，反應(yīng)體系的pH上升至8.6～8.9，這是由于2-OG在反應(yīng)過程中不斷被消耗，對(duì)反應(yīng)體系的緩沖影響很大，造成體系pH的變化，從而影響了重組酶KaPH1的活性。

2)Fe2+對(duì)trans-4-Hpro合成的影響。Fe2+是2-OG依賴的雙加氧酶的金屬中心與底物相互作用的輔因子，所以Fe2+濃度會(huì)對(duì)重組酶的活性和羥基化反應(yīng)有很大的影響[21]。針對(duì)全細(xì)胞催化系統(tǒng)(底物添加濃度20 mmol/L)，考察反應(yīng)體系中Fe2+濃度對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化活性的影響，結(jié)果如圖4(b)所示。由圖4(b)可知，F(xiàn)e2+濃度在0～1.5 mmol/L變化時(shí)，對(duì)trans-4-Hpro的產(chǎn)生沒有很大影響。隨著Fe2+濃度的繼續(xù)增加，羥脯氨酸的產(chǎn)量逐步上升，在2.5 mmol/L處達(dá)到最大產(chǎn)量為1 246 mg/L。因此，F(xiàn)e2+最適添加濃度為2.5 mmol/L。

圖4 E.coli KaPH1轉(zhuǎn)化體系各組分對(duì)L-Pro羥基化的影響Fig.4 Optimization of components in E.coli KaPH1 transformation system for L-proline hydroxylation

3)L-抗壞血酸對(duì)trans-4-Hpro合成的影響。Fe2+在水溶液中極易容易被氧化，在針對(duì)Fe(II)/2-OG 依賴型雙加氧酶催化機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)[21]，該反應(yīng)過程在某些情況下與抗壞血酸的氧化耦聯(lián)，在體外系統(tǒng)中添加抗壞血酸或其他還原劑對(duì)Fe(II)/2-OG 依賴型雙加氧酶具有一定的激活作用[22]。在考察反應(yīng)體系中L-抗壞血酸濃度對(duì)重組菌催化活性的影響時(shí)，將L-抗壞血酸濃度設(shè)定為0～30 mmol/L。由圖4(c)發(fā)現(xiàn):添加L-抗壞血酸更有利于trans-4-Hpro的合成；添加10 mmol/L抗壞血酸時(shí)，trans-4-Hpro的產(chǎn)量達(dá)到最高水平(1 158 mg/L)。隨著L-抗壞血酸濃度的持續(xù)增加，它對(duì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的緩沖體系也造成很大影響，因此，將L-抗壞血酸濃度設(shè)定為10 mmol/L。

4)CaCl2對(duì)trans-4-Hpro合成的影響。CaCl2雖然并未直接參與L-Pro的羥基化反應(yīng)，但CaCl2與菌株細(xì)胞膜的通透性有關(guān)，從而影響到產(chǎn)物的釋放，避免產(chǎn)物抑制。對(duì)轉(zhuǎn)化體系中的 CaCl2設(shè)置 0.5～4.0 mmol/L濃度梯度，所得數(shù)據(jù)結(jié)果如圖4(d)所示。由圖4(d)可知,較低濃度的CaCl2對(duì)trans-4-Hpro酸的產(chǎn)量有一定程度的提高，在0.5 mmol/L達(dá)到最高水平(1 182 mg /L)。

5)葡萄糖對(duì)trans-4-Hpro合成的影響。葡萄糖經(jīng)TCA循環(huán)化生成中間代謝產(chǎn)物2-OG[23]，2-OG氧化脫羧反應(yīng)與L-Pro的羥基化反應(yīng)相耦聯(lián)，葡萄糖含量會(huì)對(duì)trans-4-Hpro的合成有一定影響，因此對(duì)轉(zhuǎn)化體系的葡萄糖設(shè)濃度梯度，結(jié)果如圖4(e)所示。由圖4(e)可知，在添加濃度為0～30 mmol/L的范圍內(nèi)，葡萄糖濃度的升高對(duì)L-Pro的羥基化反應(yīng)較為有利，在30 mmol/L時(shí)trans-4-Hpro產(chǎn)量達(dá)到最高水平(1 112 mg/L)。但過高的葡萄糖濃度會(huì)急劇減少trans-4-Hpro的產(chǎn)生，是因?yàn)槠咸烟菨舛冗^高，導(dǎo)致重組菌的代謝副產(chǎn)物乙酸濃度增加[24]，從而對(duì)重組菌的轉(zhuǎn)化活性產(chǎn)生影響。

2.3 表達(dá)和反應(yīng)耦聯(lián)的過程調(diào)控

Studier[25]針對(duì)表達(dá)型質(zhì)粒自發(fā)誘導(dǎo)問題建立了自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，解決了原核生物高效表達(dá)過程中存在的問題。本研究中，筆者采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶表達(dá)，在體系中加入L-Pro和其他輔因子，目的是將產(chǎn)酶表達(dá)和催化過程進(jìn)行耦聯(lián)，并對(duì)體系進(jìn)行調(diào)控以建立高效發(fā)酵轉(zhuǎn)化體系(圖5)。

圖5 酶表達(dá)與反應(yīng)耦聯(lián)合成trans-4-HproFig.5 Enzyme expression and reaction coupling system for the synthesis of trans-4-Hpro

2.3.1 表達(dá)和反應(yīng)耦聯(lián)過程的溫度調(diào)控

重組酶KaPH1在20 ℃的條件下可溶性表達(dá)最好，同時(shí)通過全細(xì)胞酶活測(cè)定確定最適反應(yīng)溫度為30 ℃?，F(xiàn)在對(duì)整個(gè)反應(yīng)過程進(jìn)行階段性溫度調(diào)控，設(shè)置底物初始添加濃度為20 mmol/L，然后將反應(yīng)時(shí)間設(shè)為80 h，轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：在溫度調(diào)控途徑一條件下，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為1 662 mg/L，產(chǎn)率為63.4%；在溫度調(diào)控途徑二條件下，trans-4-Hpro為2 165 mg/L，產(chǎn)率82.6%；在溫度調(diào)控途徑三條件下，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為2 512 mg/L，產(chǎn)率95.8%；在溫度調(diào)控途徑四條件下，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為2 450 mg/L，產(chǎn)率92%。

圖6 耦聯(lián)體系合成trans-4-Hpro的溫度調(diào)控Fig.6 Temperature gradient-based regulation of coupling- system for the synthesis of trans-4-Hpro

(a)溫度調(diào)控途徑一：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，將溫度轉(zhuǎn)為30 ℃反應(yīng)60 h。(b)溫度調(diào)控途徑二：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)40 h，將溫度轉(zhuǎn)為30 ℃反應(yīng)40 h。(c)溫度調(diào)控途徑三：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)60 h，將溫度轉(zhuǎn)為30 ℃反應(yīng)20 h。(d)溫度調(diào)控途徑四：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)80 h。

由圖6結(jié)果可知，溫度調(diào)控對(duì)OD600的積累沒有太大影響，轉(zhuǎn)化過程中E.coliKaPH1最高OD600均達(dá)到15左右。同時(shí)，溫度的改變對(duì)細(xì)胞活性影響很大，其中途徑一、二體系在變溫之后，全細(xì)胞活性迅速下降。而在途徑三中，將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h，變溫為20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)60 h后全細(xì)胞比酶活仍保持在0.55 U/g，最終將溫度轉(zhuǎn)為30 ℃反應(yīng)20 h，產(chǎn)率可達(dá)到95.8%。綜上，溫度調(diào)控途徑三為有利于trans-4-Hpro的合成。

2.3.2 乳糖濃度對(duì)表達(dá)和反應(yīng)耦聯(lián)合成trans-4-Hpro的影響

重組菌株高密度生長(zhǎng)表達(dá)異源蛋白，以乳糖作為誘導(dǎo)劑可以提高蛋白表達(dá)量，降低生產(chǎn)成本[26]?？疾烊樘菨舛葘?duì)表達(dá)和反應(yīng)耦聯(lián)合成trans-4-Hpro的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，在乳糖為5 g/L時(shí)，體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量?jī)H2 802 mg/L，產(chǎn)率為53%。在5～20 g/L的范圍內(nèi)，隨著乳糖濃度的提高，體系中trans-4-Hpro的合成速率及生物量有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，酶活在36 h時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)乳糖為15 g/L時(shí)，trans-4-Hpro的產(chǎn)量達(dá)到最高為3 782 mg/L，產(chǎn)率為72%；當(dāng)乳糖提高至25 g/L時(shí)，產(chǎn)量、E．coliKaPH1 OD600及比酶活均有所降低。高濃度的乳糖雖然會(huì)加快trans-4-Hpro的前期合成速率，但是由于乳糖分解生成的半乳糖無法被大腸桿菌所利用，會(huì)造成原料的浪費(fèi)。綜上，筆者選擇在體系中添加15 g/L的乳糖濃度來誘導(dǎo)合成trans-4-Hpro。

圖7 乳糖濃度對(duì)生物合成trans-4-Hpro的影響Fig.7 Effects of lactose concentration on the synthesis of trans-4-Hpro

2.3.3 底物濃度對(duì)E.coliKaPH1合成trans-4-Hpro的影響

為進(jìn)一步探究底物濃度對(duì)耦聯(lián)轉(zhuǎn)化過程的影響，保證體系中其他因素不變的情況下提高L-pro的濃度，檢測(cè)體系中trans-4-Hpro的變化，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：L-Pro濃度為20 mmol/L時(shí)，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為2 223 mg/L，OD600達(dá)到20.89，產(chǎn)率為84.8%；L-Pro濃度為40 mmol/L時(shí)，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為3 960 mg/L，OD600達(dá)到22.14，產(chǎn)率為75.5%；L-Pro濃度為60 mmol/L時(shí)，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為4 871 mg/L，OD600達(dá)到21.12，產(chǎn)率為60.3%；L-Pro濃度為80 mmol/L時(shí)，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為6 007 mg/L，OD600達(dá)到23.16，產(chǎn)率56.4%；在培養(yǎng)基中L-Pro濃度為100 mmol/L時(shí)，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為7 860 mg/L，OD600達(dá)到22.82，產(chǎn)率為59.9%。在不同的底物濃度下，耦聯(lián)轉(zhuǎn)化體系反應(yīng)過程中中生物量的積累量變化不明顯，隨著底物濃度的升高，OD600有一定的提高。反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)在不同的底物濃度下體系中L-Pro均無剩余，但隨著底物濃度的提高，L-Pro有效轉(zhuǎn)化率逐步下降。針對(duì)E.coliKaPH1高底物濃度下有效轉(zhuǎn)化率降低和底物的異常消耗現(xiàn)象[27]，還需從代謝角度分析并對(duì)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的工程改造，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。

圖8 底物濃度對(duì)trans-4-Hpro的合成及生物量的影響Fig.8 Effects of substrate concentration on the synthesis of trans-4-Hpro and biomass

3 結(jié)論

基于已報(bào)道的P4H的基因序列，采用功能酶基因探礦方法，挖掘獲得可以高效羥基化L-Pro的新型羥基化酶KaPH1，對(duì)E.coliKaPH1轉(zhuǎn)化體系合成trans-4-Hpro進(jìn)行過程優(yōu)化，將產(chǎn)量提高了18.5%。為了拓展新酶KaPH1的高效利用，將產(chǎn)酶和催化過程耦聯(lián)并調(diào)控，添加100 mmol/L的L-Pro作為底物，有效轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60%，OD600可達(dá)到20以上。通過過程調(diào)控，提高了新酶資源的高效利用，為生物合成trans-4-Hpro高效轉(zhuǎn)化體系的建立提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。