陳曉輝，張 雪，楊廣宇

(上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海200240)

鞘糖脂(glycosphingolipids,GSLs)作為一類(lèi)典型的糖脂類(lèi)化合物，是真核生物細(xì)胞膜的重要組成部分；在原核生物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了部分鞘糖脂，如在腸道微生物BacteroidesfragilisNCTC 9343中的α-半乳糖神經(jīng)酰胺α-GalCerBf和GSL-Bf717，赫希氏大腸桿菌溶解病毒株86(EhV86)包膜中的十四酰GSLs[1-2]。它們?cè)诩?xì)胞識(shí)別、細(xì)胞免疫、細(xì)胞凋亡及病原入侵等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，并且與神經(jīng)退行性疾病、溶酶體貯積癥和癌癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3]。細(xì)胞表面GSLs可以與其他細(xì)胞表面的GSLs相互作用參與細(xì)胞識(shí)別，也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體蛋白參與信號(hào)傳導(dǎo)[4]。此外，GSLs通常是病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物入侵宿主的識(shí)別靶標(biāo)，與傳染性疾病密切相關(guān)。GSLs還參與激發(fā)多種細(xì)胞的先天型和適應(yīng)型免疫系統(tǒng)，也和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。含有唾液酸的酸性GSLs被稱(chēng)為神經(jīng)節(jié)苷脂類(lèi)，它們以高濃度存在于大腦組織和神經(jīng)系統(tǒng)中，在胚胎發(fā)生和嬰兒的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。

多種GSLs具有潛在的藥用價(jià)值，神經(jīng)節(jié)苷脂具有治療帕金森病和阿爾茨海默癥的潛力[7-8]。科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞中存在GSLs的異常表達(dá)，因此GSLs可以作為治療性疫苗的靶標(biāo)，在癌癥治療中具有潛在應(yīng)用，如含有巖藻糖基的鞘糖脂Globo H的衍生物GloboH-KLH-QS21已經(jīng)進(jìn)入臨床三期用于治療乳腺癌[9]，而Fucosly-GM1a的衍生物Fuc-GM1-KLH-QS21也具有作為疫苗用于治療小細(xì)胞肺癌的潛力[10]。在2015年，一種人類(lèi)-小鼠抗GD2嵌合單克隆抗體獲得批準(zhǔn)，用于聯(lián)合治療高風(fēng)險(xiǎn)兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤[11]。

然而，GSLs在生物體內(nèi)含量很低，并且具有高度的微觀(guān)結(jié)構(gòu)不均一性，導(dǎo)致從動(dòng)植物組織中進(jìn)行GSLs的提取效率極低。近年來(lái)，基于人工化學(xué)酶法合成及人工細(xì)胞工廠(chǎng)等人工生物合成研究為解決GSLs的大量獲取問(wèn)題提供了新的途徑。

1 鞘糖脂類(lèi)的簡(jiǎn)介及天然生物合成途徑

GSLs是典型的雙親性分子，由親水性的寡糖鏈與疏水性的神經(jīng)酰胺以糖苷鍵相連而成，其中神經(jīng)酰胺又可被分為鞘氨醇?jí)A基及脂肪酸，二者以酰胺鍵相連(圖1)。按其寡糖鏈的四糖核心序列結(jié)構(gòu)，GSLs通常可被分為7類(lèi)[12]。脊椎動(dòng)物的GSLs主要屬于ganglio、globo和neolacto系列；而在無(wú)脊椎動(dòng)物中，mollu和arthro系列GSLs占主導(dǎo)地位[13]。GSLs的鞘氨醇?jí)A基主要分成3種：D-鞘氨醇(D-sphingosine)、二氫鞘氨醇(dihydrosphingosine)和植物鞘氨醇(phytosphingosine)[14]。而GSLs中的脂肪酸種類(lèi)主要是含有14～36個(gè)碳原子的飽和脂肪酸鏈，但也有含有雙鍵或者2-羥基化修飾的脂肪酸鏈的GSLs存在[15]。由于GSLs的寡糖鏈模塊、鞘氨醇?jí)A基模塊及脂肪酶模塊均具有豐富的結(jié)構(gòu)修飾類(lèi)型，它們互相組合構(gòu)成了數(shù)量極為龐大的鞘糖脂類(lèi)化合物家族，預(yù)計(jì)自然界中存在至少10萬(wàn)種以上(www.sphingomap.org)。對(duì)鞘糖脂類(lèi)在生物體內(nèi)不同生理和發(fā)育狀態(tài)下的組成、結(jié)構(gòu)和生理功能的研究催生了“鞘糖脂組學(xué)”(Glycosphingolipidology)這一新的研究領(lǐng)域。

GSLs的天然生物合成首先發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞質(zhì)面，絲氨酸和棕櫚酰-輔酶A通過(guò)聚合反應(yīng)形成3-酮二氫鞘氨醇，之后經(jīng)過(guò)脫氫、酰化等一系列反應(yīng)生成神經(jīng)酰胺。之后神經(jīng)酰胺被轉(zhuǎn)移到高爾基體中，經(jīng)過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化形成葡萄糖神經(jīng)酰胺或半乳糖神經(jīng)酰胺[13]，作為合成后續(xù)GSLs的重要中間體。其中，葡萄糖神經(jīng)酰胺在乳糖神經(jīng)酰胺合酶的催化下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳糖神經(jīng)酰胺(LacCer)，并通過(guò)一系列糖基轉(zhuǎn)移酶的級(jí)聯(lián)催化形成asialo、ganglio、globo/iso-globo和lacto/neo-lacto等系列GSLs。而半乳糖神經(jīng)酰胺經(jīng)過(guò)唾液酸酸化后產(chǎn)生GM4神經(jīng)節(jié)苷脂，或硫酸化以產(chǎn)生硫苷脂(圖2)。這些合成后的GSLs通過(guò)囊泡運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜，形成脂質(zhì)微區(qū)域發(fā)揮其各自的生理功能[3]。

圖1 一種典型的GSLs(神經(jīng)節(jié)苷脂GT1a)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[4]Fig.1 A typical GSL (ganglioside GT1a) structure[4]

圖2 人體內(nèi)的GSLs天然合成途徑[3]Fig.2 Natural synthesis pathway of glycosphingolipids in human[3]

2 鞘糖脂的化學(xué)酶法合成

GSLs的化學(xué)全合成已經(jīng)有較多報(bào)道[16-17]。但化學(xué)合成GSLs需要極為繁瑣的保護(hù)/去保護(hù)步驟來(lái)保證其結(jié)構(gòu)中嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膮^(qū)域選擇性與立體選擇性，存在耗時(shí)費(fèi)力、產(chǎn)率低及污染重等缺陷。近年來(lái)，科學(xué)家開(kāi)始嘗試?yán)梦⑸锩噶己玫奶禺愋耘c高效的催化能力構(gòu)建GSLs合成的化學(xué)酶法及細(xì)胞工廠(chǎng)合成體系，為鞘糖脂類(lèi)的研究提供了新的機(jī)遇。對(duì)GSLs的生物合成大體可以分為3個(gè)步驟：寡糖鏈模塊的合成、鞘氨醇模塊與寡糖鏈模塊的拼接以及脂肪鏈模塊組裝，下面分別就這三部分的進(jìn)展進(jìn)行介紹。

2.1 糖鏈模塊的合成

GSLs的寡糖鏈合成以乳糖為核心起始，在一系列具有高度特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶催化下形成各類(lèi)寡糖(圖3)[4]。由于糖基轉(zhuǎn)移酶需要昂貴的糖核苷酸作為供體底物，因此人們也開(kāi)發(fā)了可以高效產(chǎn)生糖核苷酸的酶促合成體系，大大降低了寡糖合成的成本[18-20]。

Blixt等[21]利用一系列糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)了GD3、GT3、GM2、GD2、GT2和GM1等GSLs寡糖的合成，可以達(dá)到克級(jí)產(chǎn)量。他們使用的初始底物乳糖以2-疊氮乙基修飾，這種衍生物可以用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)中，并有利于與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等進(jìn)行連接[21]。Tsai等[22]通過(guò)體外酶法合成Globo五糖(Gb5)、階段特異性胚胎抗原4(SSEA4)等GSLs，產(chǎn)量也達(dá)到了克級(jí)，可用于后續(xù)的癌癥疫苗及治療的評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)。

陳希課題組的Yu等[18]對(duì)合成路徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了整合應(yīng)用，系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了用于完整神經(jīng)節(jié)苷脂及寡糖鏈合成的一鍋多酶合成體系(one-pot multienzyme systems，OPME)，在該合成體系中，把合成糖核苷酸供體的相關(guān)酶與糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，可以用簡(jiǎn)單的單糖為底物實(shí)現(xiàn)復(fù)雜糖鏈的模塊化合成，并且產(chǎn)率都在90%以上。該課題組還利用OPME合成了神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖GM3、GM2、GM1、GD3和GD2等，并以化學(xué)合成的乳糖苷鞘氨醇(LacβSph)為底物，利用OPME糖基化反應(yīng)完成糖鏈的延伸，最終再用化學(xué)法進(jìn)行酰化合成完整的神經(jīng)節(jié)苷脂，實(shí)現(xiàn)了GD2、GD3及巖藻糖基化GM1的全合成[19-20]。

Geert課題組的Li等[23]開(kāi)發(fā)了一種GSLs的磺酸鹽標(biāo)簽，能實(shí)現(xiàn)合成中間產(chǎn)物的高效固相萃取和分離，并建立了一種化學(xué)酶法合成寡糖的全自動(dòng)化平臺(tái)，可以自動(dòng)進(jìn)行多達(dá)15個(gè)合成反應(yīng)循環(huán)，合成不同種類(lèi)的復(fù)雜聚糖，包括聚n-乙酰氨基內(nèi)酯衍生物、人乳寡糖、神經(jīng)節(jié)苷脂和n-聚糖等。

曹鴻志課題組的Lu等[24]開(kāi)發(fā)了一個(gè)氧化還原體系控制的新底物工程策略，該策略是在寡糖的酶法模塊化組裝中加入對(duì)不需要唾液酸酸化位點(diǎn)進(jìn)行選擇性氧化的步驟，從而實(shí)現(xiàn)了在未氧化位點(diǎn)上的位點(diǎn)專(zhuān)一性唾液酸酸化，再通過(guò)對(duì)氧化部位進(jìn)行還原得到目標(biāo)產(chǎn)物。2019年，該課題組的Ye等[25]進(jìn)一步拓展了該底物工程策略，利用唾液酸酸化和巖藻糖糖基化的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)來(lái)精準(zhǔn)控制巖藻糖基化的修飾位點(diǎn)，最終合成了22個(gè)結(jié)構(gòu)均一的Lewis系列具有抗原活性的復(fù)雜糖鏈。

圖3 神經(jīng)節(jié)苷脂類(lèi)鞘糖脂、globo-/isoglobo-類(lèi)鞘糖脂和lacto-/neolacto-類(lèi)鞘糖脂的合成[4]Fig.3 Synthesis of ganglio glycosphingolipids,globo-/isoglobo-sphingolipids and lacto-/neolacto-sphingolipids[4]

圖4 在大腸桿菌中構(gòu)建的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1寡糖鏈的人工生物合成途徑[26]Fig.4 Metabolically engineered pathway of GM1 oligosaccharide biosynthesis in E.coli[26]

體外酶法合成需要對(duì)所用到的酶蛋白分別進(jìn)行表達(dá)、提取和純化，操作步驟較為繁瑣，而利用代謝工程手段將相關(guān)酶基因組成代謝途徑，一并在宿主中進(jìn)行表達(dá)構(gòu)建細(xì)胞工廠(chǎng)，可以更為高效地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成。2003年，Antoine等[26]首先將糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶等酶的基因?qū)氪竽c桿菌，構(gòu)建了一株可以合成GM1寡糖鏈模塊的大腸桿菌菌株(圖4)；在添加唾液酸和乳糖受體的情況下，每升大腸桿菌發(fā)酵液可產(chǎn)生0.89 g的GM1寡糖鏈和1.25 g的GM2寡糖。2005年，該小組的Antoine等[27]對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步改造，從而能生產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂GD3寡糖鏈，產(chǎn)量達(dá)到0.83 g/L，顯示了該系統(tǒng)在合成寡糖類(lèi)化合物方面具有良好的可塑性。2009年，Randriantsoa等[28]進(jìn)一步利用來(lái)自于Helicobacterpylori的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FutC)實(shí)現(xiàn)了六糖Globo H寡糖鏈的合成。2019年，筆者所在課題組的劉新平等[29]在大腸桿菌JM107中構(gòu)建了以氟化乳糖和唾液酸為底物的GM3、GM2和GM1這3種α位氟化寡糖的生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)了氟化神經(jīng)節(jié)苷脂類(lèi)寡糖在大腸桿菌中的人工生物合成途徑，為后續(xù)神經(jīng)節(jié)苷脂類(lèi)的全合成打下基礎(chǔ)。

2.2 鞘氨醇模塊的組裝

鞘糖脂內(nèi)切糖苷酶可以特異性水解GSLs中連接寡糖鏈和神經(jīng)酰胺之間的糖苷鍵。1998年，Mackenzie等[30]首次提出，將糖苷酶活性中心的親核殘基突變?yōu)椴痪邆溆H核功能的氨基酸，可以去除其天然水解活性；與此同時(shí)，利用具有自我?jiàn)Z電子能力的氟化糖作為糖基供體，則可以使糖苷水解酶變成糖苷合成酶，有效催化糖苷鍵的合成(圖5)。Caines等[31]通過(guò)對(duì)來(lái)自于馬紅球菌Rhodococcussp.M- 777的天然水解神經(jīng)節(jié)苷脂的鞘糖脂內(nèi)切酶EGCase Ⅱ進(jìn)行了分子改造，將其轉(zhuǎn)化為GSLs的糖苷合成酶，相應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到了95%；之后他們對(duì)EGCase Ⅱ再次進(jìn)行了改造，將其催化糖苷鍵合成的活性提升了3倍，并對(duì)非天然底物植物鞘氨醇產(chǎn)生了明顯的催化活性[32]。在此之后，筆者所在課題組的李卓等[33]對(duì)該酶做進(jìn)一步改造，將其催化糖苷鍵合成的活性又提升了2倍。

圖5 糖苷合成酶EGCase合成lyso-GM1的反應(yīng)機(jī)制Fig.5 Mechanism of EGC glycosynthase-catalyzed synthesis of lyso-GM1

鞘氨醇是GSLs合成中的關(guān)鍵中間體。2012年，德國(guó)的Schorsch等[34]利用代謝工程的方法，優(yōu)化了Pichiaciferrii中四乙?；参锴拾贝?TAPS)的合成代謝途徑并過(guò)量表達(dá)合成途徑中的關(guān)鍵酶，使得該菌生產(chǎn)四乙?；参锴拾贝嫉漠a(chǎn)量達(dá)到199 mg/g。隨后德國(guó)贏(yíng)創(chuàng)公司的Schaffer Steffen研究小組對(duì)Pichiaciferrii菌株進(jìn)行改造，獲得了1株能夠大量產(chǎn)生三乙?；拾贝嫉墓こ叹?，在搖瓶中三乙酰基鞘氨醇的產(chǎn)量為240 mg/L，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到890 mg/kg，而三乙酰基鞘氨醇再經(jīng)過(guò)兩步化學(xué)催化即可獲得D-鞘氨醇[35]。

2.3 脂肪鏈模塊的組裝

鞘糖脂N-去?；?sphingolipid ceramideN-deacylase，SCDase)是一種雙功能酶，同時(shí)能夠催化鞘糖脂中脂肪酸鏈和鞘氨醇鏈之間酰胺鍵水解或合成，可以應(yīng)用于溶血GSLs(lyso-GSL)的制備和GSLs脂肪鏈的組裝。1988年，Hirabayashi等[36]首次在Nocardiasp. 中發(fā)現(xiàn)具有這種活性的酶。1995年，Ito課題組的B?rgel等[35]在Pseudomonassp.TK4也發(fā)現(xiàn)這種活性的酶，首次命名為SCDase。迄今為止，已有4個(gè)具有SCDase活性的酶被報(bào)道，分別來(lái)自于Nocardiasp.[34]、Pseudomonassp.[37]、Streptomycessp.[38]和ShewanellaalgaG8[39]。筆者所在課題組的Han等[40]對(duì)來(lái)源于ShewanellaalgaG8中的SCDase進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)其催化活性可以與EGCase實(shí)現(xiàn)耦聯(lián)，不需中間純化步驟即可合成完整的神經(jīng)節(jié)苷脂，并首次成功建立了鞘糖脂模塊的體外酶法組裝體系。他們利用反應(yīng)工程策略，通過(guò)調(diào)控反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)了SCDase水解活性與合成活性的拆分，產(chǎn)率均達(dá)到95%以上，并發(fā)展了高效的GM1脂肪酸模塊酶法替換體系，制備了一系列含不飽和脂肪酸的GM1衍生物[41]。

3 總結(jié)與展望

目前GSLs的化學(xué)酶法合成取得了很多成績(jī)，一鍋多酶法(OPME)、代謝工程等新技術(shù)的發(fā)展也進(jìn)一步完善了其生物合成體系。然而，目前許多GSLs合成的關(guān)鍵酶還存在活性低、底物譜窄等缺陷，而相關(guān)細(xì)胞工廠(chǎng)構(gòu)建也僅處于初始階段。在未來(lái)，對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行新基因挖掘、分子改造與定向進(jìn)化以及利用合成生物學(xué)技術(shù)提升細(xì)胞工廠(chǎng)的系統(tǒng)整合能力，將有助于拓展人類(lèi)合成此類(lèi)關(guān)鍵化合物能力。相信隨著GSLs人工合成研究的進(jìn)一步發(fā)展，加強(qiáng)對(duì)GSLs結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)，可以促進(jìn)對(duì)其生理功能、作用機(jī)制及相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)的研究。