張桂芝，王星敏，彭榮，賀有周，張杰

(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

氫能是解決環(huán)境問題的最理想的能源[1]。生物制氫是發(fā)展新能源的一個重要研究方向[2]。具有其他制氫方法無法替代的優(yōu)越性[3]。固定化光合細菌通常比懸浮態(tài)產(chǎn)氫能力要高[4]。但固定化載體如果不透光，將影響產(chǎn)氫效率[5]。而較小比表面積載體會使得固定化細菌生物量不夠，底物利用率低。且存在細胞與底物的接觸面積較小、傳質(zhì)距離較遠、傳質(zhì)阻力大等問題[6]。

本文制作了一種透光玻璃纖維固定化光合細菌連續(xù)產(chǎn)氫反應(yīng)器，研究了光合細菌的固定化過程及其產(chǎn)氣特性，考察了底物中葡萄糖濃度，進料流速以及不同光源對產(chǎn)氫的影響，獲得了該反應(yīng)器最佳產(chǎn)氣條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

玻璃纖維(φ9～20 μm)，產(chǎn)自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；葡萄糖、氯化銨、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、鹽酸、氯化鎂、氯化鈉、甲醛均為分析純；酵母膏為生化試劑；光合細菌菌種為產(chǎn)氫紅螺菌屬沼澤紅假單胞菌[7]。

TOC-VCPN總有機碳總氮分析儀；ZDS-10自動量程照度計；SY-9303B質(zhì)量流量計；Spx-250-GB光照培養(yǎng)箱；SP6890氣相色譜儀：UV-3100PC紫外可見分光光度計；H20502-1高速冷凍離心機；FE20型酸度計。

1.2 實驗裝置

制氫反應(yīng)器(圖1)采用透光性能良好的PMMA有機玻璃制成。反應(yīng)室填充25 g玻璃纖維，作為光合細菌的固定化載體，周邊用緊固螺栓固定密封。光生化反應(yīng)室容積為120 cm3，頂部氣室容積為12 cm3，床層采光面面積為200 cm2。反應(yīng)器內(nèi)介質(zhì)流向設(shè)置為下進上出方式，反應(yīng)產(chǎn)生的氣體由頂部設(shè)置排氣孔排出，進入排水集氣管。

圖1 反應(yīng)器示意圖Fig.1 Reactor design

整個實驗裝置見圖2。用硅膠管連接各個部分，底物用恒流泵計量，氣體用帶刻度玻璃集氣管收集并計量。實驗所用玻璃設(shè)備均用高壓滅菌鍋滅菌，實驗開始前，整個管路先用36%甲醛溶液滅菌，再用滅菌的蒸餾水將整個流路徹底清洗。

圖2 實驗裝置示意圖Fig.2 The experiment system1.反應(yīng)器；2.光源燈；3.恒溫箱；4.培養(yǎng)基儲瓶；5.蠕動泵；6.廢液瓶；7.集氣裝置

1.3 實驗方法

細菌固定化階段，使用生長培養(yǎng)基，接種光合細菌，采用循環(huán)掛膜法[8]，使光合細菌在反應(yīng)器中的玻璃纖維上吸附生長。生長培養(yǎng)基[9]：NH4Cl 1.0 g/L，CH3COONa 2.0 g/L，NaHCO30.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgCl20.2 g/L，T.M液1 mL/L，酵母膏0.8 g/L。當(dāng)玻璃纖維變成鮮紅色，培養(yǎng)液OD值>0.8時，即可認(rèn)為固定化成功。

細菌固定化成功后，排出培養(yǎng)液，輸入產(chǎn)氫培養(yǎng)基，進行連續(xù)產(chǎn)氣實驗。產(chǎn)氫培養(yǎng)基配方：葡萄糖2～10 g/L，蛋白胨2.0 g/L，NaHCO30.4 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgCl20.2 g/L，NaCl 1.0 g/L，T.M儲液1 mL/L，pH調(diào)節(jié)為7。采用總有機碳及總氮分析儀分析底物濃度變化，采用氣相色譜儀分析計算產(chǎn)氫速率[10]，分別考察不同光源、不同進料流速、不同底物濃度對產(chǎn)氫過程的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化階段光合細菌的生長

將液體生長培養(yǎng)基接種后通過恒流泵注入到反應(yīng)器中，循環(huán)流動培養(yǎng)，流速控制在1 mL/min，培養(yǎng)基總量為300 mL，接種6%左右對數(shù)生長期菌懸液。接種后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過短暫的適應(yīng)期，部分細菌就開始吸附生長在玻璃纖維上，使纖維呈現(xiàn)微紅色。

圖3 固定化階段培養(yǎng)基OD值變化曲線圖Fig.3 Change of OD600，TOC，TN versustime during immobilization stage

由圖3可知，接種24 h后，TOC開始急劇下降，液體培養(yǎng)基OD值快速升高。此階段細菌快速增值，處于對數(shù)生長期。細菌在纖維載體上大量生長，纖維的顏色變化明顯，紅色逐漸加深，培養(yǎng)液中游離的光合細菌也增多，因此OD值快速升高。整個固定化過程中，反應(yīng)器出口端的氮源濃度變化不是很大，與碳源的消耗量及消耗速率相比，細菌對氮源的需求量及消耗速率并不大。

A.固定化光合細菌前 B.固定化光合細菌后圖4 玻璃纖維固定化光合細菌照片F(xiàn)ig.4 The photographs of photosyntheticbacteria immobilized on glass fiber

由圖4可知，固定化光合細菌前，反應(yīng)器中的玻璃纖維為白色，接種120 h后，由于細菌在纖維上吸附生長，玻璃纖維顏色變?yōu)轷r紅色，證明光合細菌固定成功。根據(jù)圖3可知，接種120 h后，循環(huán)液OD值>0.8，且變化趨緩，氮源和碳源的濃度變得較低。當(dāng)總有機碳<65 mg/L時，即可終止固定化過程。光合細菌固定化成功的反應(yīng)器將用于連續(xù)產(chǎn)氣實驗。

2.2 光源對代謝產(chǎn)氫過程的影響

通過調(diào)節(jié)不同的光源與反應(yīng)器之間的距離，保持同等光照強度2 000 lux，進行連續(xù)產(chǎn)氣實驗。

圖5 不同光源下TOC、TN消耗量與產(chǎn)氣速率Fig.5 TOC，TN consumption and hydrogen productionrate under different light sources

由圖5可知，對于白熾燈和日光燈，細菌產(chǎn)氣速率相當(dāng)。由于吸收波長的原因，在鈉光燈作用下產(chǎn)氣速率較低，LED燈作用下產(chǎn)氣速率最大[11]。由于白熾燈光照過程中發(fā)熱量較大，使得光反應(yīng)器局部溫度升高，而不利于光合細菌的代謝活動，因而產(chǎn)氣量較低。日光燈管由于呈柱狀，致使平面式采光面各處光照度不太一致，中間部分光照度較大，離燈管較遠的邊緣處則光照度較低，也導(dǎo)致產(chǎn)氣速率偏低。而LED光源呈平板式，各處光強相同，且能與采光面平行放置，使得反應(yīng)器受光面各處光照度相當(dāng)；同時，由于LED為冷光源，發(fā)熱量低，不會導(dǎo)致反應(yīng)器溫度升高，從而有利于反應(yīng)器溫度維持細菌生長的恒定溫度，保證其處于最佳代謝溫度，因而產(chǎn)氣率較其他光源高。不同光照情況下的TOC、TN含量則變化不太大，其中白熾燈、鈉光燈、日光燈作用下細菌對氮源和碳源的消耗量均偏低，LED燈照射下消耗的底物最多。這也與其產(chǎn)氣量最大相符。表明在這種光照條件下，有利于光合細菌的代謝和光照產(chǎn)氫，后續(xù)實驗均以LED燈作為光源。

2.3 進料流速對代謝產(chǎn)氫過程的影響

在相同的底物濃度及光照度情況下，底物進料速度對產(chǎn)氣速率會有顯著影響[12]。

圖6 流速對TOC、TN消耗量以及產(chǎn)氫速率影響Fig.6 Effect of flow rate on TOC，TN consumptionand hydrogen production rate

由圖6可知，在不同流速下，光合細菌對碳源和氮源的消耗量不同。當(dāng)進料流速<4 mL/min時，隨著流速的增大，底物消耗量有小幅上升，在4 mL/min時達到最大值。提高反應(yīng)器流速可以增加反應(yīng)器中主流區(qū)與生物膜之間的對流傳質(zhì)系數(shù)，起到強化底物從主流向生物膜傳質(zhì)過程的作用[12]。但當(dāng)流速>4 mL/min后，由于流速過快，擾動加劇，并可能將部分光合細菌生物膜沖刷掉，降低了生物膜對培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，且由于底物在反應(yīng)器內(nèi)的停留時間過短，不利于TOC、TN在反應(yīng)器內(nèi)的傳遞和反應(yīng)。因此，雖然過低的流速可能會增大傳質(zhì)阻力，使得營養(yǎng)物質(zhì)不能快速擴散至固定化細菌的細胞膜表面，但是增大了底物在反應(yīng)器內(nèi)的停留時間，因而底物消耗量比在高流速下的要高。對本反應(yīng)器而言，對流傳遞不起控制作用，底物在生物膜內(nèi)的擴散速率和菌體對底物的消耗速率決定了底物的利用效率[13]。產(chǎn)氣速率與底物消耗速率隨流速的變化呈現(xiàn)相同的趨勢。低流速更有利于固定化具體的產(chǎn)氣。因此，進料流速控制在4 mL/min為宜。

2.4 底物濃度對代謝產(chǎn)氫過程的影響

由圖7可知，細菌在葡萄糖濃度為6 g/L的情況下，產(chǎn)生氣體體積最大，此時，細菌底物中消耗的碳源、氮源均為最多。表明該細菌在葡萄糖濃度為6 g/L的情況下生長繁殖最活躍。隨著底物濃度的增加，反應(yīng)器內(nèi)主流區(qū)與生物膜區(qū)之間的傳質(zhì)驅(qū)動勢也是逐漸增加，使得更多的底物被傳遞到生物膜區(qū)域用于產(chǎn)氫代謝[14]。因此，在低底物濃度情況下，反應(yīng)器的產(chǎn)氫速率隨著底物濃度增大會逐漸增加。當(dāng)反應(yīng)器進口底物濃度繼續(xù)增加至6 g/L以上時，雖然傳遞到生物膜的葡萄糖量增大。但是超過了光合細菌生物膜的代謝能力，所以，產(chǎn)氫活性呈逐漸下降趨勢。結(jié)果表明，當(dāng)傳質(zhì)速率大于生化反應(yīng)速率時，就會對生物膜代謝產(chǎn)生抑制作用，降低光合細菌生物活性，導(dǎo)致反應(yīng)器的產(chǎn)氫速率降低。因而底物濃度必須維持在一個最佳的濃度范圍。

圖7 葡萄糖濃度下底物的消耗速率與產(chǎn)氫速率Fig.7 The rate of substrate consumption and hydrogenproduction of glucose concentrations

3 結(jié)論

(1)光合細菌能成功在玻璃纖維上固定化生長。通過不同光源下的對比產(chǎn)氣實驗，發(fā)現(xiàn)光照強度為2 000 lux下LED光源效果最佳。不同的進料流速下固定化光合細菌產(chǎn)氣量不同，高流速不利于產(chǎn)氣，最佳進料流速為4 mL/min。

(2)光合細菌在葡萄糖濃度為6 g/L時，細菌消耗的碳源、氮源均為最大，光合細菌生長繁殖最為活躍，固定化產(chǎn)生氣體量最大為61 mL/(h·m2)。

(3)采用透光玻璃纖維作為光合細菌固定化載體，既能增大光能的吸收量，又提高了生化反應(yīng)床層的比表面積，增加了光合細菌的生物量，同時可以擴大菌落與底物的接觸面積，縮短傳質(zhì)距離，從而能增大底物和光能利用率，提高產(chǎn)氫效率。