楊旸，劉健，甘禮惠，龍敏南

(廈門大學(xué) 能源學(xué)院，福建 廈門 361102)

目前，利用半纖維素獲取木寡糖的常用方法為酶水解。相較于其他方式[1-2]，酶水解污染小且產(chǎn)生的副產(chǎn)物少[3-4]。然而由于生物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，直接酶解的效率低[5]，故實(shí)驗(yàn)使用了氨水/雙氧水與球磨相結(jié)合的方式預(yù)處理大米草，在脫除木質(zhì)素的同時(shí)保留了相當(dāng)量的半纖維素，并破壞其結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

大米草中除木聚糖外還含有2.13%的側(cè)鏈阿拉伯糖[6]。因此，實(shí)驗(yàn)選擇了源于黑曲霉，在畢赤酵母中高效表達(dá)的重組內(nèi)切-β-1，4-木聚糖降解酶和重組α-L-阿拉伯糖苷酶水解經(jīng)預(yù)處理后的大米草。探究了氨水/雙氧水與球磨預(yù)處理方式相結(jié)合及協(xié)同酶解對大米草木聚糖水解效率及協(xié)同降解機(jī)制的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

大米草，收割于福建省廈門市翔安區(qū)沿海灘涂，粉碎至40～60目；氨水(25%～28%)、雙氧水(30%)、硫酸(98%)均為分析純；檸檬酸緩沖液(50 mmol/L，pH 5)；實(shí)驗(yàn)所用酶為實(shí)驗(yàn)室保存重組內(nèi)切-β-1，4-木聚糖降解酶(AnXyn10C，XC，306 IU/mL，GenBank accession No.KJ601783)，α-L-阿拉伯糖苷酶(AnAxh62A，AX，38.9 IU/mL，GenBank accession No.KJ601782)來源于黑曲霉，在畢赤酵母中高效表達(dá)。

FIWE 纖維素測定儀；QM-3Spartina04 行星式球磨機(jī)；Rigaku ULTIMA IV X射線衍射儀；Nicolet iS5 傅里葉變換紅外光譜儀；SUPRA 55 場發(fā)射掃描電鏡；Molecular Devices美國M2多功能酶標(biāo)儀；Waters2695 高效液相色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨水/雙氧水預(yù)處理 稱取2 g大米草，32 g去離子水，2 g雙氧水及6 g氨水，加入120 mL(46 mm×130 mm)耐壓瓶中。充分浸泡后的混合物分別在110，120，130 ℃的恒溫油浴鍋中反應(yīng)1，3，4，5，6 h。反應(yīng)結(jié)束后過濾分離固體，并用去離子水多次沖洗固體至中性，在75 ℃下烘至絕干，稱重后置于干燥皿室溫保存待用。

1.2.2 球磨預(yù)處理 稱取200 mg氨水/雙氧水預(yù)處理大米草及原料大米草于瑪瑙球磨罐，400 r/min下球磨2 h。球磨后的固體置于干燥皿室溫保存待用。

1.2.3 酶水解 準(zhǔn)確稱取200 mg底物于離心管，分別或同時(shí)加入135 μL的AnXyn10C與46 μL的AnAxh62A，再添加檸檬酸緩沖液至固∶液=1∶100(g/mL)，在50 ℃恒溫混勻儀中300 r/min反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后將離心管置于沸水中煮10 min滅活，再置于離心機(jī)，12 000 r/min離心5 min，收集上層清液，-20 ℃ 冷凍保存待用。計(jì)算木聚糖水解率。

木聚糖水解率=10C/S

式中C——酶水解產(chǎn)物中還原糖濃度，mg/mL；

S——預(yù)處理后固體中剩余的半纖維素含量，%。

1.3 結(jié)構(gòu)與表征

1.3.1 化學(xué)組成分析 原料大米草及預(yù)處理大米草的成分確定方法參考NREL方案[7]。酶水解液中的成分由帶有紫外檢測器及C18柱(CAPCELL PAK C18MGⅡ)的高效液相(HPLC)分析確定，方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.3.2 SEM分析 原料大米草及預(yù)處理大米草的表面形態(tài)由場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。所有樣品粉末經(jīng)過噴金處理，在20 kV下操作。

1.3.3 XRD分析 將原料大米草及預(yù)處理大米草于紅外干燥箱下干燥2 h，用瑪瑙研磨皿充分研磨至粉狀待測。測試條件：Cu靶(Kα=0.154 nm)，管電流40 mA，管電壓40 kV，掃描率為3(°)/min，從10～60°。

1.3.4 FTIR分析 將原料大米草及預(yù)處理大米草與KBr按1∶100(w/w)混合，在紅外烘干箱中研磨至粉末狀。用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析，測試條件：4 000～500 cm-1波數(shù)范圍，32次掃描，所有情況下光譜分辨率保持在4 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨水/雙氧水預(yù)處理大米草的化學(xué)組成

原料大米草的組成為纖維素34.04%，半纖維素26.45%，木質(zhì)素25.73%，水分含量約9.80%。由表1可知，經(jīng)過不同堿預(yù)處理后，大米草的固體回收率為49.00%～57.01%。其中固體的損失主要是由于生物質(zhì)在堿預(yù)處理中有部分成分溶解，如木質(zhì)素及半纖維素等。大部分的纖維素及相當(dāng)量的半纖維素被保留在了固體中，尤其是纖維素，大米草中超過95.00%的纖維素被保留了下來，沒有受到堿預(yù)處理的影響。這是由于氨水對纖維素/半纖維素低反應(yīng)性[9]的結(jié)果。由表1可以看出，最高和最低的木質(zhì)素脫除率分別為73.39% 及 61.75%，分別在堿處理?xiàng)l件為120 ℃，6 h 和 120 ℃，1 h 時(shí)發(fā)生。木質(zhì)素的脫除主要是由于氨破壞了木質(zhì)素分子間的酯鍵，而雙氧水通過其氧化作用加速了這一過程[9-10]。這些結(jié)果說明，氨水/雙氧水的預(yù)處理可以在保留相當(dāng)量的纖維素/半纖維素的情況下，脫除大部分的木質(zhì)素，而木質(zhì)素的脫除程度則隨著預(yù)處理?xiàng)l件的加劇而增大。由表1中還可以看出，堿預(yù)處理溫度從110 ℃ 升至130 ℃，木質(zhì)素脫除率從65.36% 升到 68.87%，盡管木質(zhì)素脫除量增加，但纖維素/半纖維素?fù)p失也隨之增大。這說明嚴(yán)苛的氨水/雙氧水預(yù)處理?xiàng)l件盡管有利于木質(zhì)素的脫除，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致纖維素/半纖維素的損失增大，從而使后續(xù)酶水解的糖得率降低。

表1 經(jīng)不同堿預(yù)處理?xiàng)l件處理的底物的化學(xué)成分

2.2 預(yù)處理大米草結(jié)構(gòu)的表征

2.2.1 SEM 由圖1a可知，大米草原料微觀呈桿狀，相較其他兩組表面更光滑，原料經(jīng)球磨后破碎成硬質(zhì)細(xì)小顆粒狀分散，見圖1b。由圖1c可知，經(jīng)過堿預(yù)處理的大米草，結(jié)構(gòu)被一定程度的破壞，其微觀形態(tài)雖然不如球磨處理物細(xì)小，但呈更為松散的絮狀物狀態(tài)。從酶解效率來說，底物結(jié)構(gòu)破壞程度越大，酶對底物的可及性越高，酶解效率也就越高。因此，無論經(jīng)過堿處理還是球磨處理，都有利于后續(xù)的酶解效率的提高。

圖1 原料(a)、經(jīng)球磨處理的原料(b)、120 ℃，4 h 堿預(yù)處理的大米草(c)的掃描電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig.1 SEM micrographs of raw material(a)，raw material through ball-milling(b)，120 ℃，4 h alkaline-treated condition Spartina (c)

2.2.2 XRD 經(jīng)過球磨處理的大米草及其原料的結(jié)晶情況，XRD分析見圖2。

圖2 原料(a)、120 ℃，4 h 堿預(yù)處理的大米草(b)、經(jīng)球磨處理的原料(c)的X射線衍射圖

由圖2可知，最大的峰 2θ=22°代表了天然纖維素(002)衍射面[9]，小峰 2θ=34° 代表了(004)衍射面，這個(gè)峰在球磨預(yù)處理的底物圖2b中不再明顯，說明結(jié)晶區(qū)有所破壞。而在經(jīng)過球磨預(yù)處理的底物圖2c中則已經(jīng)被完全消失?？芍?，球磨對生物質(zhì)底物結(jié)晶度的破壞明顯，這是因?yàn)榍蚰w維素的結(jié)晶區(qū)域具有破壞作用[11]。

2.2.3 FTIR 圖3是不同處理?xiàng)l件下底物的紅外分析譜圖。

由圖3可知，3 400 cm-1代表生物質(zhì)中吸附的水分子的O—H伸縮振動(dòng)峰；2 910，1 420 cm-1主要對應(yīng)的是對稱和不對稱的C—H伸縮振動(dòng)；1 060 cm-1附近的兩個(gè)峰與碳水化合物的C—O和C—H伸縮振動(dòng)有關(guān)[12]；895 cm-1與纖維素中的C—H 振動(dòng)有關(guān)，是纖維素的吸收特征峰；1 260 cm-1是木質(zhì)素酯鍵的C—O—C振動(dòng)造成的?？芍獰o論是球磨，還是氨水/雙氧水的預(yù)處理，基本都不改變底物的成分，只改變組分含量。

圖3 原料(a)、經(jīng)球磨處理的原料(b)、120 ℃，4 h堿預(yù)處理的原料(c)的傅里葉紅外光譜圖

2.3 預(yù)處理對木聚糖降解酶協(xié)同作用的影響

大米草經(jīng)過氨水/雙氧水120 ℃預(yù)處理4 h時(shí)，酶解還原糖得率見表2和圖4，堿預(yù)處理結(jié)合球磨處理的大米草酶解還原糖得率見表3和圖5。

表2 堿預(yù)處理底物的還原糖得率

圖4 經(jīng)不同溫度(4 h)、不同時(shí)間(120 ℃)堿預(yù)處理的底物及原料的酶解所得還原糖濃度Fig.4 The reducing sugar concentration of substrate just pretreated by alkali at different temperatures(4 h)， at different time (120 ℃) and raw material

由表2及表3可知，經(jīng)過球磨預(yù)處理的底物，協(xié)同酶解所得的還原糖濃度是沒有經(jīng)過球磨的近7倍，未經(jīng)過球磨的底物即使在木質(zhì)素脫除率很高的情況下，半纖維素仍然沒有很高的協(xié)同酶解率(表2)，由圖4可知，兩種木聚糖降解酶間的協(xié)同作用并不明顯。這主要是由于堿預(yù)處理無法破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，而這些結(jié)晶結(jié)構(gòu)阻礙了木聚糖降解酶對半纖維素的可及性。

表3 堿預(yù)處理結(jié)合球磨處理底物的還原糖得率Table 3 The reducing sugar yield of alkali pretreatment conditions that combined with ball-milling

注：只經(jīng)球磨處理的大米草。

由圖5可知，兩種酶協(xié)同的效果優(yōu)于單獨(dú)使用其中一種酶。這主要是因?yàn)锳nXyn10C能夠切斷木糖單元間的β-1，4糖苷鍵，從木聚糖主鏈上釋放木單糖[13]，Axh62A則能通過水解木聚糖側(cè)鏈上阻礙AnXyn10C作用于主鏈的阿拉伯糖基來改善水解效果[14]。在110 ℃、堿預(yù)處理4 h結(jié)合球磨，木聚糖降解酶的協(xié)同酶解可以得到最高的還原糖得率。故選擇110 ℃、4 h作為酶解底物的預(yù)處理?xiàng)l件，通過液相分析可知，水解物成分木糖占12.54%，木二糖占40.38%，阿拉伯糖占4.65%。說明經(jīng)過預(yù)處理的底物由木聚糖降解酶協(xié)同酶解，除了產(chǎn)生木糖外，更多產(chǎn)生具有高附加價(jià)值的木寡糖。

圖5 經(jīng)不同溫度(4 h)、不同時(shí)間(120 ℃)堿預(yù)處理結(jié)合球磨(BM)預(yù)處理的底物及原料(R)酶解所得還原糖濃度

3 結(jié)論

(1)氨水/雙氧水預(yù)處理能夠有效脫除大米草中所含的木質(zhì)素，有利于后續(xù)木聚糖降解酶的水解，但對纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)無影響。

(2)球磨預(yù)處理可以破壞生物質(zhì)所含纖維素的結(jié)晶區(qū)域，從而降低底物的結(jié)晶度，使得木聚糖降解酶對底物的可及性增大。故球磨與氨水/雙氧水預(yù)處理相結(jié)合可促進(jìn)木聚糖降解酶的酶解。

(3)實(shí)驗(yàn)室的重組木聚糖主鏈酶及側(cè)鏈酶可以結(jié)合氨水/雙氧水及球磨預(yù)處理更大程度的發(fā)揮對大米草的協(xié)同酶解效果。生產(chǎn)具有高附加價(jià)值的木寡糖和阿拉伯糖。