王 軍，陳廣宏，何壽昕，張紅見 ，張 壽

（1.青海省湟中縣畜牧獸醫(yī)站，湟中 810004；2.青海大學(xué)，西寧 810016）

奶牛乳房炎（Mastitis）又稱乳腺炎，是國內(nèi)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的一大頑疾，可給奶牛生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。引起奶牛乳房炎的病原菌有數(shù)十種之多，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，約占所有病原菌的90%以上，而大腸桿菌性乳房炎一年四季均可發(fā)生，發(fā)病率相對較高[1]。目前，由大腸桿菌引起的奶牛乳房炎逐漸增加，特別是奶業(yè)發(fā)達國家，大腸桿菌性奶牛乳房炎發(fā)病率已經(jīng)達到了28.39%。我國由大腸桿菌引起的奶牛乳房炎的比例也特別高，如佛山地區(qū)大腸桿菌性乳房炎發(fā)病率達到了50%，蘭州地區(qū)達到了24.44%[2]。近年來，青海省奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)逐漸擴大，奶牛存欄急劇增加，乳房炎的發(fā)病率也居高不下，導(dǎo)致奶牛的淘汰率上升，牛奶品質(zhì)降低，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此本研究對青海省部分規(guī)?；膛鲆鹉膛Ｈ榉垦椎闹饕≡M行了調(diào)查，并對主要病原菌進行了鑒定和藥敏試驗，以期為當(dāng)?shù)厝榉垦椎姆乐翁峁﹨⒖家罁?jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 樣品來源

本試驗于2018年8月份隨機收集青海省湟中縣、大通縣、樂都縣、湟源縣的5個規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場乳房炎患牛乳頭的乳汁、腹瀉犢牛的肛拭子、運動場地面拭子、產(chǎn)房各個位置拭子、擠奶臺及擠奶機拭子，共142份樣品裝入無菌采集管中進行編號，置-20℃冰箱備用。

1.1.2 試劑

營養(yǎng)肉湯（HB0108)、營養(yǎng)瓊脂（HB0109）、伊紅美藍（EMB)瓊脂（MC03807）等試劑均購自于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。革蘭氏染色液、26種生化鑒定管等購自于北京路橋技術(shù)股份有限公司。

藥敏紙片10種，分別是氟苯尼考、頭孢他啶、萬古霉素、阿莫西林、氨芐西林、痢特靈、復(fù)方新諾明、丁胺卡那、鏈霉素、青霉素，10種藥敏紙片均購自于北京路橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 試驗主要儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS-50＊65；上海市躍進醫(yī)療器械一廠），恒溫恒濕箱（LHS-250HS-1；上海一恒科技有限公司），恒溫氣浴搖床（THZ-92B；金壇市儀器公司），-80℃超低溫冰柜（8525型；美國Forms Scintific公司）。

1.1.4 實驗動物

健康昆明系小鼠50只（不分雌雄），均購自于西寧市城北興慧養(yǎng)殖場。

1．2 方法

1.2.1 樣品增菌處理

用移液管分別無菌吸取采集管中的乳汁樣品加到滅菌的營養(yǎng)肉湯小試管中，用無菌的鑷子夾取采集管中的棉拭子加到滅菌的營養(yǎng)肉湯小試管中，置37℃回旋式氣浴震蕩器恒溫培養(yǎng)18～24h。

1.2.2 細菌的分離

分別在超凈工作臺上用接種環(huán)無菌勾取上述增菌培養(yǎng)液1～2環(huán)，劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（SS培養(yǎng)基平板、EMB培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基平板、鮮血瓊脂培養(yǎng)基），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h后觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 目的菌的純化與移植

挑取在選擇性培養(yǎng)基上的可疑菌落進行革蘭氏染色、鏡檢并進行多次純化，將已經(jīng)純化好的細菌分別接種在營養(yǎng)瓊脂斜面上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后置于4℃冰箱中備用。

1.2.4 生化鑒定

將已經(jīng)純化的細菌分離株分別無菌接種到葡萄糖等26種生化鑒定管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中24～48h后，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 毒力試驗

將健康昆明系小鼠進行標(biāo)號，分別腹腔接種不同樣品中分離純化后的目的菌，觀察小鼠24h內(nèi)的發(fā)病及死亡情況，并對死亡小鼠立即進行剖檢，取心、肝、腎、肺進行組織觸片、染色、鏡檢。

1.2.6 藥敏試驗

將已純化的細菌分別接種到普通瓊脂斜面上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，然后用生理鹽水無菌沖洗斜面，與麥?zhǔn)媳葷峁苓M行比濁后選取一定濃度的細菌懸液，用滅菌的棉簽蘸取菌液，把多余的菌液在試管內(nèi)壁上擠去，在MH（A）培養(yǎng)基上均勻涂布，涂布整個平板的1/3后將平板旋轉(zhuǎn)60°后，再進行涂布，直到涂滿整個平板，連續(xù)涂3次。最后用無菌的鑷子夾取10種藥敏紙片貼在涂好菌液的培養(yǎng)基上，每塊培養(yǎng)基貼3片，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中先正置培養(yǎng)30min，再倒置培養(yǎng)18～24h后進行結(jié)果判定（參照CISI藥敏紙片擴散法標(biāo)準(zhǔn)進行判定）。

2 結(jié)果

2．1 樣品增菌處理

用移液管分別無菌吸取采集管中的乳汁樣品加到滅菌的營養(yǎng)肉湯小試管中，用無菌的鑷子夾取采集管中的棉拭子加到滅菌的營養(yǎng)肉湯小試管中，置37℃回旋式氣浴震蕩器恒溫培養(yǎng)18～24h后部分試管液體變混濁。

2．2 細菌分離

將上述試管中變混濁的菌液用無菌的接種環(huán)勾取2～3環(huán)分別接種于選擇性培養(yǎng)基（SS培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基）上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后能長出不同的菌落，挑取疑似大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌的可疑菌落進行純化，最后得到目的菌共28株（表1）。

表1 疑似大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌的分離情況

2．3 菌落形態(tài)及染色特性

2.3.1 大腸桿菌

疑似菌在SS培養(yǎng)基上生長呈現(xiàn)紅色或粉紅色菌落，在EMB培養(yǎng)基上生長呈現(xiàn)深紫色，并且?guī)в薪饘俟鉂?。革蘭氏染色呈陰性，細菌形態(tài)為短小的桿狀并且單個存在（圖1、圖2）。初步判定為大腸桿菌。

圖1 疑似大腸桿菌菌落形態(tài)

圖2 疑似大腸桿菌鏡下形態(tài)（100×10油鏡）

2.3.2 金黃色葡萄球菌

圖3 疑似金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)

圖4 疑似金黃色葡萄球菌鏡下形態(tài)（100×10油鏡）

疑似菌在BP培養(yǎng)基上生長呈現(xiàn)黑色、凸起菌落，在普通營養(yǎng)瓊脂上呈現(xiàn)白色光滑、不透明的菌落，放置3～4d后菌落有明顯的金黃色。革蘭氏染色呈陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列，無芽孢、莢膜（圖3、圖4）。初步判定為金黃色葡萄球菌。

2.3.3 鏈球菌

疑似菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)灰色、表面凸起的細小菌落。革蘭氏染色為圓形或是卵圓形呈鏈狀排列的陽性菌（圖5）。初步判定為鏈球菌。

圖5 疑似鏈球菌鏡下形態(tài)（100×10油鏡）

2．4 生化鑒定

將分離得到的分離株分別無菌接種到葡萄糖等26種生化反應(yīng)管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中48h，分別確定為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌。

2．5 毒力試驗

腹腔接種金黃色葡萄球菌疑似菌、大腸桿菌疑似菌和鏈球菌疑似菌小鼠表現(xiàn)為厭食、精神沉郁，隨之在24h內(nèi)全部死亡。對小鼠進行剖檢，可見明顯敗血癥癥狀，腸道出血，黏液呈黃色，回收臟器觸片染色、鏡檢，其形態(tài)與接種菌一致。

2．6 藥敏試驗

檢測結(jié)果顯示，大腸桿菌對氟苯尼考高度敏感，對頭孢他啶、丁胺卡那比較敏感，對青霉素、鏈霉素等其他藥物基本耐藥。金黃色葡萄球菌對萬古霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢他啶敏感，對其他藥物基本耐藥。鏈球菌對阿莫西林、氨芐西林敏感，對其他藥物耐藥。

3 討論

從本次調(diào)查的結(jié)果可以看出，引起乳房炎的細菌主要是大腸桿菌（14.08%），其次為金黃色葡萄球菌（4.23%）和鏈球菌（1.41%），這與有關(guān)資料報道[1～3]的基本一致，但檢出率較低。分析此原因主要是，乳房炎的發(fā)生與當(dāng)?shù)氐臍夂蚝团龅男l(wèi)生狀況具有很大的關(guān)系，本次試驗采取樣本時間在8月份，也是青海省氣候條件最好時期，光照時間長且紫外線強，這可能是本次試驗細菌檢出率較低的原因。在所檢測的5個奶牛場中，衛(wèi)生條件較差的奶牛1場細菌的檢出率相對較高?？梢?，加強環(huán)境的衛(wèi)生治理是降低乳房炎發(fā)病率的有效途徑之一。

大腸桿菌是奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病的主要致病菌之一，同時也是威脅人類食品安全的主要細菌。金黃色葡萄球菌也是引起奶牛發(fā)生乳房炎的致病菌，常引起慢性和亞臨床型奶牛乳房炎，同樣會嚴(yán)重威脅人類健康，如發(fā)生金黃色葡萄球菌性乳房炎時，乳汁中會有大量的金黃色葡萄球菌，盡管加工過程中細菌會死亡，但其分泌的毒素仍殘留在乳汁中，一旦食用就會引起毒素中毒，引起嚴(yán)重腹瀉、腸炎甚至死亡[4]。在獸醫(yī)臨床上隨著抗菌藥物的大范圍使用，導(dǎo)致細菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重[5]，所以極易形成耐藥性。從本次實驗中的藥物耐藥性可以看出，導(dǎo)致奶牛乳房炎的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌都已經(jīng)對常用的青霉素、鏈霉素產(chǎn)生了極強的耐藥性。這提示奶牛場在平時的治療過程中，應(yīng)避免長期大劑量應(yīng)用同一類型抗生素，只有科學(xué)用藥才能提高治療效果，保障食品安全。